Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Studerar TGF-β signal- och TGF-β-inducerad epitelial-till-mesenkymal övergång i bröstcancer och normala celler

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61830
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Oncode Institute and Department of Cell Chemical Biology, Leiden University Medical Center

ERRATUM NOTICE

Summary

Vi beskriver ett systematiskt arbetsflöde för att undersöka TGF-β signalering och TGF-β-inducerad EMT genom att studera protein och gen uttryck som är involverade i denna signalering utbildningsavsnitt. Metoderna inkluderar western blotting, en luciferase reporter analys, qPCR och immunofluorescens färgning.

Abstract

Omvandla tillväxtfaktor-β (TGF-β) är en utsöndrad multifunktionell faktor som spelar en nyckelroll i intercellulär kommunikation. Perturbations av TGF-β signalering kan leda till bröstcancer. TGF-β framkallar dess effekter på spridning och differentiering via specifika cellytan TGF-β typ I- och typ II-receptorer (dvs. TβRI och TβRII) som innehåller en inneboende serin/treoninkinasdomän. Vid TGF-β-inducerad heteromeric komplexa bildandet, aktiverade TβRI framkallar intracellulära signalering genom fosforylerande SMAD2 och SMAD3. Dessa aktiverade SMADs bildar heteromeriska komplex med SMAD4 för att reglera specifika målgener, inklusive plasminogenaktiveringshämmare 1 (PAI-1, kodad av SERPINE1-genen). Induktion av epitelial-till-mesenchymal övergång (EMT) tillåter epitelial cancerceller på den primära platsen eller under kolonisering på avlägsna platser att få en invasiv fenotyp och driva tumörprogression. TGF-β fungerar som en potent inducerare av bröstcancer invasion genom att driva EMT. Här beskriver vi systematiska metoder för att undersöka TGF-β signalering och EMT svar med premalignant mänskliga MCF10A-RAS (M2) celler och mus NMuMG epitelceller som exempel. Vi beskriver metoder för att bestämma TGF-β-inducerad SMAD2 fosforylering av västra blotting, SMAD3/SMAD4-beroende transkriptionell verksamhet med luciferase reporter verksamhet och SERPINE1 mål gen uttryck genom kvantitativ realtid-polymeras kedjereaktion (qRT-PCR). Dessutom beskrivs metoder för att undersöka TGF-β-inducerad EMT genom att mäta förändringar i morfologi, epitelial och mesenchymal markör uttryck, filamentous aktin färgning och immunofluorescens färgning av E-cadherin. Två selektiva små molekyl TGF-β receptorkinashämmare, GW788388 och SB431542, användes för att blockera TGF-β-inducerad SMAD2 fosforylering, mål gener och förändringar i EMT markör uttryck. Dessutom beskriver vi transdifferentiering av mesenchymala bröst Py2T murin epitelial tumör celler i adipocytes. Metoder för att undersöka TGF-β-inducerad signalering och EMT i bröstcancer kan bidra till nya terapeutiska metoder för bröstcancer.

Introduction

Cytokinen som omvandlar tillväxtfaktor β (TGF-β) är prototypen av en stor grupp strukturellt och funktionellt relaterade regulatoriska polypeptider inklusive TGF-βs (dvs. TGF-β1, -β2 och -β3), benmorfogena proteiner (BMPs) och aktiviner1,2. Dessa cytokiner spelar alla viktiga roller i embryonal utveckling och för att upprätthålla vävnad och organhomeostas3. Felregleringen av TGF-β leda till ett stort antal sjukdomar, inklusive cancer4,5. TGF-β spelar en komplex, dubbel roll i cancerprogression: i normala och premalignant epitelceller beter sig TGF-β som en tumördämpare genom att hämma spridningen och inducera apoptos6,7; i det sena skedet av tumörprogressionen när cytostatika svar blockeras av aktivering av oncogenes eller förlust av tumör suppressor gener, TGF-β fungerar som en tumör förstärkare genom att främja epitelial-till-mesenchymal övergång (EMT) i cancerceller, vilket möjliggör cancer cell invasion och metastasering, verkar på celler i tumör microenvironment, och stimulera angiogenes och immunundvikande 8,9,10.

TGF-β utsöndras som en inaktiv prekursormolekyl som innehåller den mogna karboxyterminalen TGF-β och latens-associerade peptiden (LAP)11. Detta lilla komplex kan kovaly bindas av latent TGF-β-bindande protein (LTBP)12. Frisättningen av mogna TGF-β kan förmedlas genom verkan av specifika proteaser som klyver LAP eller genom mekanisk dragning av LAP i en integrinberoende process13,14. Förutom LTBP, Glykoprotein En upprepning dominerande (GARP) uttrycks högt på ytan av reglerande T-celler (Tregs) och spelar en liknande roll som LTBP i regleringen av aktiveringen av TGF-β15,16. GARP binder direkt till latent TGF-β genom disulfidlänkage och icke-covalent associering. Aktiveringen av TGF-β garp/TGF-β kräver integrins17. Mogna TGF-β binder till TGF-β serin/treoninkinasreceptorer, dvs. TGF-β typ I (TβRI) och TGF-β typ II(TβRII) receptorer18 för att initiera signalering. Bindningen av TGF-β till TβRII främjar rekryteringen av TβRI och bildandet av ett heteromeriskt komplex. Därefter fosforyleras TβRIRI med TβRII-kinaser på serin- och treoninrester i ett kort glytin- och serinrikt (GS) motiv, vilket resulterar i aktivering19,20. Vid aktivering rekryterar och fosforylerar aktiverade TβRI sina substrat: de två receptorspecifika SMADs (R-SMADs) som inkluderar SMAD2 och SMAD3 (Figur 1). R-SMADs delar en liknande övergripande struktur med två så kallade Mad homology-domäner, MH1 och MH2, som separeras av en proline-rik linkerregion (Figur 2). DNA-bindningsmotivet inom MH1-domänen SMAD3 bevaras inte mellan SMAD2 och SMAD3, och SMAD2 kan inte direkt binda DNA på grund av två infogningar i sin MH1-domän (exon 3 och L1). SMAD2 och SMAD3 kan aktiveras genom fosforylering av SSXS-motivet i deras C-termini (figur 2). Fosforylerad SMAD2/3 bildar heteromeriska komplex med en gemensam SMAD-medlare, SMAD4, som flyttar in i kärnan för att modulera transkriptionen av målgener (figur 1)7,21. Denna kanoniska SMAD-signalväg är exakt reglerad och genererar specifika cellulära och vävnadssvar som reglering av cellens öde och tumörcellsmetastas och invasion22. Förutom TGF-β-SMAD-signalering kan icke-SMAD-signalvägar också aktiveras direkt av receptorer för att reglera nedströms cellulärasvar 23.

Under tumör progression, aktivering av TGF-β-inducerad SMAD-beroende och SMAD-oberoende vägar behövs för induktion av EMT. EMT är en reversibel process där tumörceller dedifferentierar sig från en epitelial fenotyp, vilket är förknippat med förlust av cellcellskontakter och minskad apical-basal polaritet, till en mesenchymal fenotyp med förbättrad motilitet och invasionsförmåga24. EMT kännetecknas av ökat uttryck av mesenkymala markörproteiner, inklusive N-cadherin, vimentin, Zeb2 och Snail1/2, och samtidig nedreglering av epitelmarkörer, såsom E-cadherin och β-catenin (Figur 3)25. Övergången från ett epitelial till ett mesenchymalt tillstånd är dock ofta ofullständig, och celler får blandade epitelial och mesenchymala (E/M) egenskaper. Ett nytt dokument av International EMT association föreslog att beskriva processen med celler som genomgår mellanliggande E/M fenotypiska tillstånd som epitelial-mesenchymal plasticitet (EMP)26. Denna plasticitet avser partiell EMT, en hybrid E/M-status, ett metastabilt EMT-tillstånd, ett EMT-kontinuum och ett EMT-spektrum26. Under EMT får tumörceller cancerstamcellsegenskaper (CSC) och blir mer resistenta mot lösgöring-inducerad apoptos27. Medan EMT är ansvarig för förvärvet av en invasiv fenotyp i primära tumörceller och driver cancerprogression, däremot, mesenchymal-epitelial övergång (MET) har visat sig spela en viktig roll i utväxten av spridas tumörceller på avlägsna ögonbevarande platser28,29. En ny studie visade att EMT-härledda bröstcancerceller kan transdifferentieras till adipocyter, vilket kan erbjuda en möjlighet att hämma metastasering och övervinna behandlingsresistens i tumörceller och återfallscancer30. På grund av den viktiga rollen av TGF-β signalering i aktiveringen av EMT i bröst carcinogenes, Vi presenterar detaljerade protokoll för västra blotting, en luciferase transcriptional reporter analys, kvantitativ realtid-polymeras kedjereaktion (qRT-PCR) och immunofluorescens för undersökning av TGF-β signalering, TGF-β-inducerad EMT och transdifferentiering av EMT-härledda murin bröst epitelial tumör i adipocytes. Dessa tekniker är de vanligaste analysverktygen inom cellbiologiområdet. qRT-PCR används för att upptäcka, karakterisera och kvantifiera mRNA-uttrycksnivåer på ett kvantitativt sätt. Jämfört med kvantitativ PCR (qPCR), en alternativ teknik, kan omvänd transkription (RT)-PCR användas för att bestämma mRNA-uttryck på ett semikvantitativtsätt 31,32. Western blotting används för att undersöka specifika proteinnivåer i ett givet celllyatprov med fördelar av känslighet och specificitet, på ett semikvantitativt sätt. Således presenterar vi ett systematiskt arbetsflöde för att analysera förändringar från genuttryck till proteinuttryck för att hjälpa till att undersöka TGF-β signalering som också kan tillämpas på andra signalvägar.

Protocol

1. Analys av TGF-β SMAD2 fosforylering med hjälp av västerländsk blotting

OBS: Premalignant mänskliga bröst MCF10A-Ras celler användes som ett exempel för att undersöka TGF-β signalering svar33. I princip är de metoder som beskrivs nedan också tillämpliga på andra TGF-β-lyhörda cellinjer.

  1. Kultur bröstepitela cellinjen MCF10A-Ras vid 37 °C i Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM)/F12 innehållande L-glutamin med 5% hästserum, 20 ng/ml epidermal tillväxtfaktor (EGF), 10 mg/ml insulin, 100 ng/ml kolera enterotoxin, 0,5 mg/ml hydrokortison och 1:100 penicillin-streptomycin (Pen-Strep).
  2. Trypsinize MCF10A-Ras celler med 1 ml 0,25% trypsin-EDTA i 1 minut och räkna livskraftiga celler med hjälp av en cellräknare.
  3. Fröceller till 6-brunnsplattor med en densitet av 5×105 celler / brunn.
  4. Efter nattens tillväxt, behandla celler med antingen TGF-β (5 ng/mL) eller ligandbuffert (4 mM HCl, 0,1% fettsyrafri bovint serumalbumin (BSA)) i 1 timme och ta sedan bort odlingsmediet och tvätta försiktigt cellerna två gånger med 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
  5. Kyl celler i 6-brunnsplattor på is och tillsätt 150 μL förkyld radioimmun utfällningsanalys (RIPA) lysbuffert (150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0 och ny tillsatt mini proteashämmarcocktail). Låt lyset fortsätta på is i 10 minuter.
  6. Skrapa av vidhäftande celler från skålen med hjälp av en plastcellsskrapa och överför sedan försiktigt cellfjädringen till ett förkylt mikrocentrifugrör.
  7. Centrifugera celllyaten i 10 minuter vid 150 centrifugalkraft (x g) vid 4 °C och överför supernatanten till ett friskt 1,5 mL mikrocentrifugrör.
  8. Mät proteinkoncentrationen med hjälp av ett tvättmedelskompatibelt (DC) proteintestsats.
  9. Ladda 30 μg protein från varje prov på en 10% natriumdidcylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) gel och kör gelén med en spänning på 100 V i 1,5-2 timmar.
  10. Överför proteinerna från gelén till ett 45-μm polyvinyliden difluoridmembran (PVDF) med en spänning på 110 V i 1-1,5 timmar.
  11. Överför PVDF-membranet till en lämplig behållare med proteinsidan (den sida som var vänd mot gelén) upp och skölj kort membranet i destillerat vatten.
  12. Kassera vattnet, tillsätt Ponceau S-lösningen och lägg membranet på en gungplattform i 1-2 minuter.
  13. Avfärga membranet med destillerat vatten genom att snabbt skölja det och sedan tvätta det i 1 minut.
  14. Lägg sedan PVDF-membranet på en ljuslåda och ta en bild för att kontrollera om proteinbelastningarna är lika stora.
  15. Tvätta membranet med Tris-buffrad saltlösning med Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl och 0,1% Tween 20) tills det inte finns någon synlig färgning.
  16. Sätt membranet i blockeringsbuffert (5% skummjölk i TBST-lösning) och inkubera det i 1 timme vid rumstemperatur.
  17. Tvätta membranet två gånger med TBST.
  18. Inkubera membranet med primära antikroppar mot fosfo-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, hemgjorda 34),totalt SMAD2/3 1:1000 och glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas (GAPDH; 1:1000), över natten vid 4 °C.
  19. Tvätta membranet två gånger med TBST och inkubera membranet med en sekundär antikropp mot kanin eller mus (1:5000) i 2 timmar.
  20. Inkubera PVDF-membranet med västra ECL-substratet i 30 sekunder och detektera signalen med hjälp av ett bildsystem.
  21. Upprepa experimenten minst tre gånger för att få biologiska triplicater.

2. Analys av TGF-β SMAD3-beroende transkriptionssvar

  1. Utför den SMAD3/SMAD4-beroende CAGA12-luciferase transcriptional reporter analys.
    1. Kultur och trypsinize MCF10A-Ras celler som beskrivs i steg 1. Fröceller i 24-brunnsplattor vid 5×104 celler /brunn och låt cellerna klibba över natten.
    2. Dagen efter sådd, cotransfect cellerna i varje brunn med 100 ng av TGF-β/SMAD3-inducible (CAGA)12 luciferase transcriptional reporter konstruktion35 och 80 ng av β-galactosidase uttryck konstruktion med polyethylenimine (PEI). Transfection av β-galactosidase används för att normalisera skillnader i transfection effektivitet mellan olika brunnar. Ställ in varje experimentell grupp i tre exemplar.
    3. Efter 24 timmars inkubation svälter celler med serumfri DMEM-hög glukos och, 6 timmar senare, tillsätt TGF-β (5 ng/mL) eller ligandbuffert (4 mM HCl, 0,1% BSA) som fordonskontroll till cellerna.
    4. Efter ytterligare 24 timmars inkubation, tvätta cellerna två gånger med förvärmd PBS.
    5. Tillsätt 120 μL/brunn 1× lysbuffert och skaka försiktigt plattan vid 4 °C i 20 minuter.
    6. Överför 30 μL lysat till varje brunn i en 96-brunns vit analysmikroplatta för att mäta luciferasaktivitet med hjälp av en luminometer.
    7. Överför 50 μL lysat till varje brunn på en 96-brunns transparent platta för att mäta β-galactosidase-aktivitet.
    8. Normalisera luciferasaktiviteten till β-galactosidase-aktiviteten och upprepa experimenten minst tre gånger för att få biologiska triplicater.
  2. Analysera uttrycket av TGF-β målgener med kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (qRT-PCR).
    1. Kultur och trypsinize MCF10A-Ras celler som beskrivs i steg 1. Fröceller i 6-brunnsplattor vid 5×105 celler /brunn och låt cellerna klibba över natten.
    2. Behandla celler med TGF-β (5 ng/mL) eller ligand buffert (4 mM HCl, 0,1% BSA) i 6 timmar och tvätta sedan cellerna två gånger med 1 ml PBS.
    3. Isolera totalt RNA med hjälp av ett RNA-isoleringskit.
    4. Bestäm RNA-koncentrationen med en NanoDrop och utför cDNA-syntes med 1 μg RNA med hjälp av en första sträng cDNA-syntessats.
    5. Använd ett PCR-detekteringssystem i realtid för att utföra kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) med tiofaldig utspädd cDNA i en 10 μL reaktionsblandning som innehåller specifika främre och omvända primers för GAPDH (för normalisering), SERPINE1 (kodning av PAI-1-proteinet, en TGF-β/SMAD målgen), SMAD7 (TGF-β/SMAD målgen) och qPCR Master Mix. Ställ in varje experimentell grupp i tre exemplar.
      OBS: Primersekvenserna som används för att detektera mål mänskliga gener i qRT-PCR listas i tabell 1.
    6. Använd följande qPCR-reaktionsförhållanden: initiering, 95 °C i 3 minuter; denaturering, 95 °C i 10 sekunder; glödgning, 60 °C i 30 sekunder, och förlängning, 80 °C i 10 sekunder, denaturering, glödgning och förlängning upprepas 40 gånger.
    7. Upprepa experimenten minst tre gånger för att få biologiska triplicater.

3. Analys av TGF-β-inducerad EMT

  1. Analysera uttrycket av EMT-markörer på proteinnivå med hjälp av western blotting.
    OBS: Analysen av TGF-β-inducerad EMT visas med mus NMuMG epitelceller som exempel36,37.
    1. Kultur NMuMG celler vid 37 °C i DMEM-hög glukos medium kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum och 1:100 Pen-Strep. Använd metoder som beskrivs i steg 1 för proteinisolering och detektion.
      OBS: Följande antikroppar används i detta experiment: E-cadherin, 1:1000; N-cadherin, 1:1000; Snigel, 1:1000; Slug, 1:1000; Tubulin, 1:1000 (Figur 3).
  2. Analysera uttrycket av EMT-markörer på mRNA-nivå med kvantitativ realtids-PCR enligt beskrivningen i steg 2.2.
    OBS: Alla musprimrar som används för qRT-PCR, inklusive CDH1 (kodning av E-cadherinproteinet), SNAILoch ZEB2 (Figur 3) anges i tabell 1.
  3. Analysera EMT-processen med hjälp av indirekt immunofluorescens och direkt fluorescensfärgning.
    1. Indirekt immunofluorescensfärgning av E-cadherin
      1. Placera sterila 18 mm-sida fyrkantiga glaslock i 6-brunnsplattor (ett locklip per brunn).
      2. Frö 1×105 NMuMG-celler med 2 ml komplett DMEM per 6-brunnsplatta och låt cellerna klibba över natten.
      3. Flytta försiktigt täckglasen med vidhäftande celler till en ny 6-brunnsplatta och tillsätt 2 ml odlingsmedium till brunnarna.
      4. Behandla cellerna med TGF-β (5 ng/mL) eller ligandbuffert (4 mM HCl, 0,1% BSA) i 2 dagar.
      5. Ta bort odlingsmediet och tvätta försiktigt cellerna två gånger med 1 ml förvärmd PBS.
      6. Fixera cellerna genom att tillsätta 1 ml 4% paraformaldehyd och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Tvätta sedan cellerna två gånger med 1 ml PBS.
      7. Permeabilisera de fasta cellerna med 0,1% Triton X-100 i 10 minuter vid rumstemperatur och tvätta cellerna två gånger med PBS.
      8. Blockera cellerna med 5% BSA i PBS i 1 timme vid rumstemperatur och tvätta cellerna två gånger med PBS.
      9. Tillsätt den primära antikroppen mot E-cadherin (utspädd 1:1000 i PBS) till toppen av varje täckglas och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
      10. Ta bort den primära antikroppen och tvätta täcket med PBS tre gånger.
      11. Tillsätt Alexa Fluor 555 sekundär antikropp (utspädd 1:500 i PBS) till toppen av varje täckglas och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur medan du täcker med aluminiumfolie för att skydda mot ljus.
      12. Ta bort den sekundära antikroppen och tvätta täcket med PBS tre gånger.
      13. Montera täckglaset (celler vända nedåt) på glasrutschbanor med monteringsmedium med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och förvara de monterade diabilderna i en låda vid 4 °C, skyddade mot ljus.
      14. Observera färgning med SP8 konfokal mikroskopi.
    2. Direkt fluorescens färgning av filamentous (F)-aktin.
      1. Förbered proverna enligt steg 3.3.1.1. till 3.3.1.9.
      2. Färga cellerna genom att tillsätta Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:1000) i 1 timme vid rumstemperatur i mörkret för att visualisera filamentöst aktin (F-aktin).
      3. Tvätta celler tre gånger med PBS.
      4. Montera täcket på glasrutschbanor med monteringsmedium med DAPI och ta bilder med SP8 konfokal mikroskopi.

Representative Results

Analys av TGF-β signalering
Det viktigaste steget i TGF-β-signalering är fosforylering av de två mest karboxyrterminalsservinrester i SSXS-motivet (Figur 2) av TβRI-kinas38,39. För att undersöka TGF-β signalering svar, utförde vi västra blotting av fosforylerade SMAD2. I de premalignant mänskliga bröst MCF10A-Ras cellerna ökade fosforyleringen av SMAD2 avsevärt som svar på TGF-β stimulering i 1 timme, medan uttrycket av totala SMAD2/3 påverkades inte av TGF-β behandling (Figur 4A). Genom att använda TGF-β-inducerad SMAD3/4-driven CAGA-luc transkriptionell reporter analys, fann vi att TGF-β markant inducerad luciferase reporter i MCF10A-Ras celler linje jämfört med icke-behandlade celler (Figur 4B). Dessutom observerade vi att väl karakteriserade direkta transkriptionella genmål för TGF-β inklusive SMAD7 och SERPINE1 (kodning av PAI-1 proteinet), uttrycktes starkt i TGF-β-behandlade MCF10A-Ras celler (Figur 4C).

Analys av TGF-β-inducerad EMT
Vi bedömde TGF-β-inducerad EMT med olika metoder, såsom morfologiska förändringar, uttryck av EMT markörer vid mRNA och protein nivåer och immunofluorescens färgning av EMTmarkörer 36. NMuMG epitelceller behandlade med TGF-β i 1 och 2 dagar ändrades från en klassisk epitelial morfologi till en spindelformad mesenkymal-liknande morfologi, vilket visas av faskontrastmikroskopi (Figur 5A). I överensstämmelse med de morfologiska förändringarna observerade vi att TGF-β behandling ledde till en ökning av proteinuttrycket av mesenchymal markörer, inklusive N-cadherin, Snail, och Slug37 (Figur 5B). Däremot var E-cadherin, en epitelmarkör, nedreglerad i NMuMG-celler efter 2 dagar av TGF- β behandling (figur 5B). Dessutom utförde vi kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (qRT-PCR) för att undersöka genuttrycket av EMT-markörer. CDH1 (kodning av E-cadherin proteinet) minskade betydligt, medan mesenchymal markörer såsom SNIG och zink finger E-box-bindande homeobox 2 (ZEB2) ökade markant efter TGF-β stimulering i NMuMG celler jämfört med obehandlade celler (Figur 5C). TGF-β-inducerad EMT i NMuMG celler bekräftades ytterligare av immunofluorescens färgning av E-cadherin. Vid TGF- β stimulering i 2 dagar uttryckte NMuMG-celler mindre E-kadherin än celler i den oinducerade kontrollgruppen, som analyserats av confocal mikroskopi (Figur 5D). Dessutom bildade NMuMG-celler i närvaro av TGF-β mer aktinstressfibrer, vilket framgår av konfokal mikroskopi (Figur 5E).

SB431542 och GW788388 hämmar TGF-β signalering och TGF-β-inducerad EMT
SB431542 är en ATP-hämmare av kinasdomänen TβRI, även kallad aktivinreceptorliknande kinas 5 (ALK5), medan GW788388 hämmar TβRI- och TβRII-kinasaktivitet. Båda hämmarna kan hämma TGF-β receptor signalering40. Således behandlade vi NMuMG celler med olika koncentrationer av GW788388 i närvaro av TGF-β i 1 timme. Som förväntat hämmade GW788388 TGF-β-inducerad SMAD2 fosforylering på ett dosberoende sätt (figur 6A). Dessutom blockerades TGF-β-medierad fosforylering av SMAD2 av SB431542-behandlingen(figur 6A). Fosforylerad SMAD2/3 bildar ett heteromeriskt komplex med SMAD4 och flyttar in i kärnan för att modulera transkriptionen av målgener. Därför undersökte vi flyttning av SMAD2/3 i NMuMG celler genom immunofluorescens färgning av SMAD2/3. Uppgifterna visade att både SB431542 och GW788388 avsevärt hämmade den TGF- β-inducerade nukleära flyttningen och ackumuleringen av SMAD2/3 i NMuMG-celler(figur 6B). Dessutom observerades de hämmande effekterna av SB431542 och GW788388 också i mRNA-uttrycksnivåerna för viktiga TGF-β-målgener som är involverade i EMT, inklusive PAI-1, SNAIL, E-cadherin och Fibronectin (Figur 6C). Dessa data föreslog att SB431542 och GW788388 blockerade TGF-β signalering och TGF-β-inducerad EMT.

Analys av transdifferentiering av mesenkymala bröstcancerceller till adipocyter
EMT spelar en viktig roll för att förbättra cellplastiken i cancer och resulterar i utveckling av terapiresistens. Cancercellsplastitet kan riktas direkt och hämmas med en trans-differentieringsmetod, såsom påtvingad adipogenesis30. Vi använde Py2T murin bröstcancer celler, som härrörde från bröst körtel av en mus bröst tumör virus-polyoma mellersta tumör-antigen (MMTV-PyMT) transgen mus, som en cellulär modell av EMT-inducerad cancer cell plasticitet. Baserat på ett etablerat protokoll41, behandlade vi EMT-härledda Py2T murin bröstcancerceller med anti-diabetiker drogen rosiglitazone i 10 dagar för att inducera adipogenesis. Adipogenesis bedömdes genom visualisering lipid droppar med olja röd O färgning. Fettceller upptäcktes lätt i rosiglitazonbehandlade Py2T-murinbröstcancerceller (figur 7), vilket visade att behandling med enbart rosiglitazon är tillräcklig för att främja transdifferentieringen av EMT- härledda bröstcancerceller till adipocyter.

Figure 1
Figur 1: TGF-β/SMAD-signalering. TGF-β signalering initierar med bindningen av TGF-β till TGF-β typ II receptor (TβRII), en konstitutivt aktiv kinas, som fosforylerar TGF-β typ I receptor (TβRI). Sedan aktiverade TβRI kinas fosforylat SMAD2/3. En peptid som innehåller SSXS-motivet SMAD2 med två karboxyrterminalfosforylerade serinrester användes för att erhålla polyklonal antisera som känner igen fosfor-SMAD2 (p-SMAD2). Därför kan analysen av p-SMAD2-uttrycket av western blotting användas för att bestämma aktiveringen av TGF-β signalvägen. Fosforylerade SMAD2/3 kan bilda heteromeriska komplex med SMAD4, som sedan flyttar in i kärnan för att modulera transkriptionssvar. CAGA12-luciferase reporter analys och kvantitativ realtid PCR (qRT-PCR) för mRNA uttryck av TGF-β mål gener såsom SMAD7 och SERPINE1 (kodning PAI-1 protein), kan användas för att analysera TGF-β-inducerad SMAD3-beroende transkriptionssvar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Schematisk struktur för R-SMADs (SMAD2 och SMAD3). MH1-domänerna (blå) och MH2 (gul) bevaras bland R-SMADs, men länkningsområde (grått) bevaras inte. MH1-domänen SMAD3 har ett DNA-bindande motiv, medan SMAD2 inte direkt kan binda DNA, på grund av en insättning (exon 3) i sin MH1-domän. MH2-domänen förmedlar SMAD-oligomerisering, interaktion med TGF-β-receptorer och proteinbindning och är involverad i transkriptionell reglering. SMAD2 och SMAD3 kan aktiveras genom fosforylering av SSXS-motivet (i rött) i deras C-termini. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: TGF-β-inducerad EMT. Under TGF-β-inducerad epitelial-mesenchymal övergång (EMT), cellerna genomgår förlust av epitelial och förvärv av mesenchymala egenskaper med förbättrad cell motility och invasion förmåga. Induktion av EMT leder till uttryck av mesenchymala markörer som N-cadherin, Zeb2 och Snail1/2, liksom nedreglering av epitelmarkörer inklusive E-cadherin, β-catenin och claudin-1. Den ackumulerade förlusten eller vinsten av epitelial/mesenchymala (E/M) egenskaper gör att en cell går in i mellanliggande tillstånd på ett reversibelt sätt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: TGF-β signalsvar i MCF10A-Ras-celler. (A) MCF10A-Ras celler behandlades antingen med eller utan TGF-β (2,5 ng/mL) i 1 timme, och cell lysates var immunoblotted för fosforylerade SMAD2 (p-SMAD2), totala SMAD2/3 och GAPDH (som en lastning kontroll). Storleksmarkören visas till höger. Con: Kontrollgrupp utan TGF-β behandling. (B) Analys av TGF-β (5 ng/mL) verksamhet med hjälp av SMAD3-SMAD4-beroende CAGA12-luciferase (LUC) transkriptionell reporter i MCF10A-Ras celler. Värdena normaliseras till β-galactosidase (βGal) aktivitet. Uppgifterna uttrycks som medelvärdet ± s.d, n = 3. Studentens t-test, ***P ≤ 0,001 (C) qRT-PCR-analys av TGF-β målgenerna SMAD7 och SERPINE1 (kodning av PAI-1-proteinet) i MCF10A-Ras-celler behandlade med TGF-β (2,5 ng/mL) i 6 timmar. GAPDH användes som intern kontroll. Uppgifterna uttrycks som medelvärdet ± s.d, n = 3. Studentens t-test, ***P ≤ 0,001. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: TGF-β-inducerad EMT i NMuMG-celler. a)Morfologi av NMuMG-celler som behandlats med TGF- β (2, 5 ng/ml) i 1 eller 2 dagar. I närvaro av TGF-β, NMuMG celler transdifferentierades till en mesenchymal fenotyp. Skala bar = 150 μm (B) NMuMG celler behandlades med eller utan TGF-β (5 ng/mL) i 2 dagar, och EMT markörer analyserades av västra blotting. Storleksmarkören är som anges till höger. Con: Kontrollgrupp utan TGF-β behandling. C)Genuttrycksanalys av EMT-markörer(CDH1 (kodning av E-cadherinproteinet),SNI och ZEB2) i NMuMG-celler som behandlats i 2 dagar med TGF-β (5 ng/ml). GAPDH användes som intern kontroll. Resultaten uttrycks som medelvärdet ± s.d., n = 3. Studentens t-test, *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001. (D) NMuMG celler var färgas av immunofluorescens för att upptäcka uttrycket av epitelial markör E-cadherin (röd) efter TGF-β (2,5 ng/mL) behandling i 2 dagar. Nuclei kontrades med DAPI (blå). Bilder togs med konfokal mikroskopi. Skala bar = 50 μm (E) NMuMG celler var färgade med fluorescein-falloidin (grön) att visualisera F-aktin. Nuclei kontrades med DAPI (blå). Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: TGF-βsignaling och TGF-β-inducerad EMT hämmades av SB431542 och GW788388. (A) NMuMG-celler behandlades med 10 μM SB431542 (SB) eller de angivna koncentrationerna av GW788388 (GW) i närvaro eller frånvaro av TGF-β (5 ng/ml) i 1 timme. Cell lysates var immunoblotted för p-SMAD2, SMAD2/3 och GAPDH. (B) NMuMG-celler behandlades med 5 μM SB431542 (SB) eller 10 μM GW788388 (GW) i närvaro eller frånvaro av 5 ng/ml TGF-β i 1 timme och fläckas av immunofluorescens för att upptäcka nukleär flyttning av SMAD2/3 (grön). Bilder togs med konfokal mikroskopi. (C) Uttryck av TGF-β målgener, inklusive PAI-1 och gener som kodar EMT markörer, inklusive SNI, E-Cadherin och Fibronectin, analyserades genom omvänd transkriptas polymeras kedjereaktion (RT-PCR) i NMuMG celler efter SB eller GW behandling och TGF-β stimulering i 48 timmar. GAPDH fungerade som lastkontroll. Kontrollen betecknar icke behandlade celler. Denna siffra har ändrats från Petersen M. m.fl. 34 med tillstånd från utgivaren. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: EMT-härledda Py2T-murin bröstcancerceller kan induceras för att differentiera sig till adipocyter. Py2T murin bröstcancer celler stimulerades med 2 ng/mL TGF-β i 20 dagar att inducera fullständig EMT. Sedan behandlades cellerna antingen med DMSO som en fordonskontroll eller rosiglitazon (2 μM) i 10 dagar för att möjliggöra differentiering av mesenkymala cancerceller och inducera adipogenes. Mediet ändrades varannan dag. Efter 10 dagars behandling färgades cellerna med oljeröd O. Scale bar = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Arter Gennamn Framåt (5'till 3') Omvänd (5'till 3')
Mänskliga GAPDH (2000 TGCACCACCAACTGCTTAGC GGCATGGACTGTGGTCATGAG (GGCATGGACTG)
SMAD7 (SMAD7) TCCAGATGCTGTGCCTTCC GTCCGAATTGAGCTGTCCG (GTCCGAATTGAGCTG)
SERPINE1 (SERPINE1) CACAAATCAGACGGCAGCACT (CACAAATCAGACGGCAGCACT) CATCGGGCGTGGTGAACTC
Musen GAPDH (2000 TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC (TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC) AAGATGGTGATGGGCTTCCCG (OLIKA BETYDELSER)
CDH1 (cdh1) ACCAAAGTGACGCTGAAGTC GAGGATGTACTTGGCAATGG
Snigel CAGCTGGCCAGGCTCGGT (CAGCTGGCCAGGCTCGGT) GCGAGGGCCTCCGGAGCA (PÅ GCGAGGGCCTCCGGAGCA)
ZEB2 (zeb2) TTCTGCAAGCCTCTGTAGCC TTCTGGCCCCATTGCATCAT

Tabell 1: Primers som används för qRT-PCR.

Discussion

TGF-β/SMAD signalering spelar en central roll i bröstcancer progression, eftersom det kan främja bröstcancer cell invasivitet och metastasering genom att inducera EMT7. Här beskrev vi ett logiskt arbetsflöde för att undersöka TGF-β-initierad signalering från receptorinducerad SMAD-aktivering till SMAD-medierade transkriptionella och biologiska svar. Vi började med att beskriva analysen av SMAD2 fosforylering, fortsatte med TGF-β-inducerad SMAD3-beroende transkriptionssvar och EMT markör uttryck vid både genen och protein nivåer att analysera TGF-β/SMAD signalering svar, och slutligen undersökt TGF-β-inducerad EMT. Vi använde CAGA12-luciferase transcriptional reporter som innehåller CAGA lådor härrör från PAI-1 promotorn, för att övervaka aktiviteten hos TGF-β/SMAD signalväg35. Den här reporterkonstruktionen kräver SMAD3 och SMAD4 för aktivering. Tidigare studier har visat att knockdown av SMAD4 försvagade TGF-β-inducerad CAGA12-luciferase aktivitet37. Förutom reporteranalysen är fastställandet av fosforyleringsstatusen för endogena SMADs, inklusive SMAD2 och SMAD3, ett annat sätt att undersöka TGF-β signalsvar. Andra medlemmar av TGF-β-familjen, såsom tillväxt- och differentieringsfaktor (GDF)-8/myostatin och GDF-9, omvandlar också signaler via SMAD2/3-proteiner genom att engagera TβRI42,43,44. Förutom CAGA12-luciferase reporter, flera liknande reportrar har använts för att upptäcka aktivering av TGF-β signalering. Till exempel kan en transkriptionell (SBE)4-Lux-reporter med svarselement som härrör från JunB-promotorn effektivt induceras av TGF-β, aktiviner och BMPs45.

Western blotting och qPCR användes för att analysera TGF-β-inducerad EMT, som är klassiska metoder för att undersöka uttrycket av epitelial markörer (dvs. E-cadherin) och mesenchymal markörer (dvs. N-cadherin, Snail, Slug och Zeb2). Vi utförde också indirekt immunofluorescens färgning av E-cadherin och direkt fluorescens färgning av F-aktin. Dessa analyser validerade ytterligare mesenchymal fenotyp av celler efter TGF-β behandling. Begränsningen av immunofluorescensfärgning är att celler måste fixeras före inkubation med antikroppar och avbildning, och det är svårt att undersöka förändringar i EMT-marköruttryck i levande celler. Nyligen har utformningen av EMT-reporter cellinjer, såsom A549 lung adenocarcinom-vimentin-RFP, gjort det möjligt att övervaka omvandlingen av epitelceller till mesenchymala celler i realtid via uttryck av röda fluorescerande protein (RFP)-märkt vimentin. Denna plattform skulle kunna användas för läkemedelsscreening och ny läkemedelsutveckling46. LifeAct färgämne, en 17-aminosyra peptid, som kan färga F-aktin strukturer i levande celler, blir ett värdefullt verktyg för att visualisera aktin cytoskeleton i realtid utan att störa cellulära processer47. I denna studie använde vi två småmolekylhämmare, SB431542 och GW788388, för att validera deras hämmande effekt på TGF-β signalering och TGF-β-inducerad EMT. GW788388 hämmar särskilt kraftigt aktiviteten i TβRI och TβRII, medan SB431542 endast har en hämmande effekt på TβRI (och ALK4 och ALK7). Tidigare studier visade att GW788388 är mer potent in vivo än SB43154240. Förutom hämningen av EMT minskade GW788388 uttrycket av fibrosmarkörer i njuren och oral administrering av GW788388 hos diabetiker möss minskade markant glomerulopati25,48.

EMT spelar en viktig roll för att främja cancercells plasticitet och resulterar i läkemedelsresistens och metastasering 49. Därför har inriktning på EMT-härledda celler med specifika cytotoxiskaläkemedel 50 eller inducera redifferentiering via mesenchymal-till-epitelial övergång (MET)51 föreslagits som ett tillvägagångssätt för att övervinna cancercellsmetastas och terapiresistens. Met bidrar dock till spridningen av spridade cancerceller i avlägsna organ52, vilket kan vara kontraproduktivt när man använder terapeutisk reversion av EMT. Nyligen rapporterade en ny studie en terapeutisk transdifferentieringsmetod genom att direkt rikta in sig på EMT-härledda bröstcancerceller för differentiering till adipocyter30. Studien av Ishay-Ronen et. 30 använde py2T-epitelcancerceller som hade genomgått en övergång till mesenkymala celler som svar på långtidsbehandling med TGF- β. De visade att rosiglitazon i kombination med MEK-hämmare förbättrade epitelial differentiering och adipogenesis. Vi fann dock att rosiglitazon ensam var tillräckligt för att inducera transdifferentiering av mesenchymal Py2T murin celler i adipocyter.

Sammanfattningsvis gav metoderna som används i denna studie ett logiskt arbetsflöde för att undersöka TGF-β signalering och TGF-β-inducerad EMT. De två hämmarna, SB431542 och GW788388, kan blockera TGF-β-inducerade svar och EMT. Dessutom visade vi också rosiglitazone ensam inducerar adipogenesis i vissa TGF-β-inducerad mesenchymal bröstcancer celler. Även om vi bara använde flera bröstcancer cellinjer för att undersöka TGF-β svar, de metoder som beskrivs här kan extrapoleras till andra (cancer) celler. Här använde vi olika TGF-β koncentrationer för att inducera cellulära svar. I de flesta celltyper utövar TGF-β sin biologiska aktivitet i koncentrationsområdet 0,01-10 ng/ml53 och inducerar signalering i ett dosresponsmönster. I primära endotelceller, inklusive bovina kolorektal endotelceller, framkallade TGF-β det väsentliga uttrycket av fosforylerad SMAD2 vid 0,025 ng/mL, nådde ett maximum på 0,25 ng/mL och förblev på denna nivå som svar på högrekoncentrationer 53. I vår studie använde vi en hög koncentration av TGF-β (5 ng/mL) i MCF10A-Ras celler för transkriptionell reporter analys för att få starka svar. SMAD2 fosforylering och mål gen uttryck kan induceras av TGF-β vid en låg dos; Således använde vi 2,5 ng/mL TGF-β för att behandla celler. Den lämpligaste arbetskoncentrationen beror dock på celltyp och uppskattade effekter. För att bestämma den bästa koncentrationen av TGF-β rekommenderas behandling av cellerna med olika doser (från låg till hög).

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi erkänner stödet från Chinese Scholarship Council (CSC) till J.Z. och Cancer Genomics Centre Netherlands (CGC. NL) till P.t.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
18 mm-side square glass coverslips Menzel Gläser 631-1331
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Vector Laboratories H-1200
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 555 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21422
Anti-E-cadherin antibody BD Biosciences 610181
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody Merck Millipore MAB374
Anti-N-cadherin antibody BD Biosciences 610920
Anti-Slug antibody Cell Signaling Technology 9585
anti-SMAD2/3 antibody Becton Dickinson 610842
Anti-Snail antibody Cell Signaling Technology 3879
Anti-Tubulin antibody Cell Signaling Technology 2148
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Cholera enterotoxin Sigma-Aldrich C8052
Clarity Western ECL Substrate Bio-Rad 1705060
DC protein assay kit Bio-Rad 5000111
DMEM-high glucose Thermo Fisher Scientific 11965092
DMEM-high glucose medium Thermo Fisher Scientific 11965092
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F12 Thermo Fisher Scientific 11039047
epidermal growth factor (EGF) Merck Millipore 01-107
Fetal bovine serum (FBS) BioWest S1860-500
GoTaq qPCR Master Mix PROMEGA A600X
Horse serum Thermo Fisher Scientific 26050088
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0135
Insulin Sigma-Aldrich 91077C
Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
NucleoSpin RNA II kit BIOKE´ 740955
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Thermo Fisher Scientific 15140148
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck Millipore IPVH00010
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific K1621
Rosiglitazone Sigma-Aldrich 557366-M
Skimmed milk Campina: Elk
Equipment
ChemiDoc Imaging System Bio-Rad 17001402
CFX Connect Detection System Bio-Rad 1855201
Luminometer Perkin Elmer 2030-0050
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tzavlaki, K., Moustakas, A. TGF-β Signaling. Biomolecules. 10 (3), (2020).
  2. Hao, Y., Baker, D., Ten Dijke, P. TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Cancer Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), (2019).
  3. Morikawa, M., Derynck, R., Miyazono, K. TGF-β and the TGF-β Family: Context-Dependent Roles in Cell and Tissue Physiology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (5), (2016).
  4. Derynck, R., Akhurst, R. J. Differentiation plasticity regulated by TGF-β family proteins in development and disease. Nature Cell Biology. 9 (9), 1000-1004 (2007).
  5. Massague, J. How cells read TGF-β signals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (3), 169-178 (2000).
  6. Seoane, J., Gomis, R. R. TGF-β Family Signaling in Tumor Suppression and Cancer Progression. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (12), (2017).
  7. Colak, S., Ten Dijke, P. Targeting TGF-β Signaling in Cancer. Trends in Cancer. 3 (1), 56-71 (2017).
  8. Suriyamurthy, S., Baker, D., ten Dijke, P., Iyengar, P. V. Epigenetic Reprogramming of TGF-β Signaling in Breast Cancer. Cancers (Basel). 11 (5), (2019).
  9. Drabsch, Y., Ten Dijke, P. TGF-β signalling and its role in cancer progression and metastasis). Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3-4), 553-568 (2012).
  10. Goumans, M. J., Ten Dijke, P. TGF-β Signaling in Control of Cardiovascular Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), (2018).
  11. Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-β and TGF-β-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), (2016).
  12. Robertson, I. B., et al. Latent TGF-β-binding proteins. Matrix Biology. 47, 44-53 (2015).
  13. Khan, Z., Marshall, J. F. The role of integrins in TGF-β activation in the tumour stroma. Cell and Tissue Research. 365 (3), 657-673 (2016).
  14. Jenkins, G. The role of proteases in transforming growth factor-β activation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1068-1078 (2008).
  15. Tran, D. Q., et al. GARP (LRRC32) is essential for the surface expression of latent TGF-β on platelets and activated FOXP3+ regulatory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13445-13450 (2009).
  16. Stockis, J., Colau, D., Coulie, P. G., Lucas, S. Membrane protein GARP is a receptor for latent TGF-β on the surface of activated human Treg. European Journal of Immunology. 39 (12), 3315-3322 (2009).
  17. Wang, R., et al. GARP regulates the bioavailability and activation of TGF-β. Molecular Biology of the Cell. 23 (6), 1129-1139 (2012).
  18. Vander Ark, A., Cao, J., Li, X. TGF-β receptors: In and beyond TGF-β signaling. Cellular Signalling. 52, 112-120 (2018).
  19. Heldin, C. H., Miyazono, K., ten Dijke, P. TGF-β signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins. Nature. 390 (6659), 465-471 (1997).
  20. ten Dijke, P., Hill, C. S. New insights into TGF-β-Smad signalling. Trends in Biochemical Sciences. 29 (5), 265-273 (2004).
  21. Miyazono, K. TGF-β signaling by Smad proteins. Cytokine & Growth Factor Reviews. 11 (1-2), 15-22 (2000).
  22. Yu, Y., Feng, X. H. TGF-β signaling in cell fate control and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 61, 56-63 (2019).
  23. Zhang, Y. E. Non-Smad pathways in TGF-β signaling. Cell Research. 19 (1), 128-139 (2009).
  24. Katsuno, Y., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-β signaling and epithelial-mesenchymal transition in cancer progression. Current Opinion in Oncology. 25 (1), 76-84 (2013).
  25. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (3), 178-196 (2014).
  26. Yang, J., et al. Guidelines and definitions for research on epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 341-352 (2020).
  27. Zhang, Y., Weinberg, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition in cancer: complexity and opportunities. Frontiers in Medicine. 12 (4), 361-373 (2018).
  28. Brabletz, T., Kalluri, R., Nieto, M. A., Weinberg, R. A. EMT in cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (2), 128-134 (2018).
  29. Ocana, O. H., et al. Metastatic colonization requires the repression of the epithelial-mesenchymal transition inducer Prrx1. Cancer Cell. 22 (6), 709-724 (2012).
  30. Ishay-Ronen, D., et al. Gain Fat-Lose Metastasis: Converting Invasive Breast Cancer Cells into Adipocytes Inhibits Cancer Metastasis. Cancer Cell. 35 (1), 17-32 (2019).
  31. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiology Ecology. 67 (1), 6-20 (2009).
  32. Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
  33. Sundqvist, A., et al. JUNB governs a feed-forward network of TGF-β signaling that aggravates breast cancer invasion. Nucleic Acids Research. 46 (3), 1180-1195 (2018).
  34. Persson, U., et al. The L45 loop in type I receptors for TGF-β family members is a critical determinant in specifying Smad isoform activation. FEBS Letters. 434 (1-2), 83-87 (1998).
  35. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF-β-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. The EMBO Journal. 17 (11), 3091-3100 (1998).
  36. Piek, E., Moustakas, A., Kurisaki, A., Heldin, C. H., ten Dijke, P. TGF-β type I receptor/ALK-5 and Smad proteins mediate epithelial to mesenchymal transdifferentiation in NMuMG breast epithelial cells. Journal of Cell Science. 112, Pt 24 4557-4568 (1999).
  37. Deckers, M., et al. The tumor suppressor Smad4 is required for transforming growth factor-β-induced epithelial to mesenchymal transition and bone metastasis of breast cancer cells. Cancer Research. 66 (4), 2202-2209 (2006).
  38. Souchelnytskyi, S., et al. Phosphorylation of Ser465 and Ser467 in the C terminus of Smad2 mediates interaction with Smad4 and is required for transforming growth factor-β signaling. Journal of Biological Chemistry. 272 (44), 28107-28115 (1997).
  39. Abdollah, S., et al. TβRI phosphorylation of Smad2 on Ser465 and Ser467 is required for Smad2-Smad4 complex formation and signaling. Journal of Biological Chemistry. 272 (44), 27678-27685 (1997).
  40. Petersen, M., et al. Oral administration of GW788388, an inhibitor of TGF-β type I and II receptor kinases, decreases renal fibrosis. Kidney International. 73 (6), 705-715 (2008).
  41. Gubelmann, C., et al. Identification of the transcription factor ZEB1 as a central component of the adipogenic gene regulatory network. Elife. 3, 03346 (2014).
  42. Nickel, J., Ten Dijke, P., Mueller, T. D. TGF-β family co-receptor function and signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 50 (1), 12-36 (2018).
  43. Mazerbourg, S., et al. Growth differentiation factor-9 signaling is mediated by the type I receptor, activin receptor-like kinase 5. Molecular Endocrinology. 18 (3), 653-665 (2004).
  44. Rebbapragada, A., Benchabane, H., Wrana, J. L., Celeste, A. J., Attisano, L. Myostatin signals through a transforming growth factor-β-like signaling pathway to block adipogenesis. Molecular and Cellular Biology. 23 (20), 7230-7242 (2003).
  45. Jonk, L. J., Itoh, S., Heldin, C. H., ten Dijke, P., Kruijer, W. Identification and functional characterization of a Smad binding element (SBE) in the JunB promoter that acts as a transforming growth factor-β, activin, and bone morphogenetic protein-inducible enhancer. Journal of Biological Chemistry. 273 (33), 21145-21152 (1998).
  46. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).
  47. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  48. Gellibert, F., et al. Discovery of 4-{4-[3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]pyridin-2-yl}-N-(tetrahydro-2H- pyran-4-yl)benzamide (GW788388): a potent, selective, and orally active transforming growth factor-β type I receptor inhibitor. Journal of Medicinal Chemistry. 49 (7), 2210-2221 (2006).
  49. Ishay-Ronen, D., Christofori, G. Targeting Cancer Cell Metastasis by Converting Cancer Cells into Fat. Cancer Research. 79 (21), 5471-5475 (2019).
  50. Gupta, P. B., et al. Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening. Cell. 138 (4), 645-659 (2009).
  51. Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), (2016).
  52. Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Cancer Research. 72 (6), 1384-1394 (2012).
  53. Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-β type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).

Tags

Cancerforskning utgåva 164 som omvandlar tillväxtfaktor-β epitelial-till-mesenkymal övergång bröstcancer western blotting transkriptionell reporter immunofluorescens hämmare adipogenesis

Erratum

Formal Correction: Erratum: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells
Posted by JoVE Editors on 12/15/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. NMuMG was mislabeled as cancer cells.

NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-β in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

Studerar TGF-β signal- och TGF-β-inducerad epitelial-till-mesenkymal övergång i bröstcancer och normala celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Thorikay, M., van der… More

Zhang, J., Thorikay, M., van der Zon, G., van Dinther, M., ten Dijke, P. Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. J. Vis. Exp. (164), e61830, doi:10.3791/61830 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter