Fremstilling af 3D-hjertemikrovævarrays ved hjælp af humane iPSC-afledte kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller
Summary
Her beskriver vi en brugervenlig metode til at generere 3D-selvmonterede hjertemikrotissue-arrays sammensat af prædifferentierede humaninducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller. Denne brugervenlige og lavcellekrævende teknik til at generere hjertemikrotiser kan implementeres til sygdomsmodellering og tidlige stadier af lægemiddeludvikling.
Abstract
Generering af humane kardiomyocytter (PM’er), hjertefibroblaster (CF’er) og endotelceller (EC’er) fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) har givet en unik mulighed for at studere det komplekse samspil mellem forskellige kardiovaskulære celletyper, der driver vævsudvikling og sygdom. Inden for hjertevævsmodeller bruger flere sofistikerede tredimensionelle (3D) tilgange inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (iPSC-PM’er) til at efterligne fysiologisk relevans og indfødt vævsmiljø med en kombination af ekstracellulære matricer og tværbindinger. Disse systemer er imidlertid komplekse at fremstille uden mikrofabrikationsekspertise og kræver flere uger at samle sig selv. Vigtigst af alt mangler mange af disse systemer vaskulære celler og hjertefibroblaster, der udgør over 60% af nonmyocytterne i det menneskelige hjerte. Her beskriver vi afledningen af alle tre hjertecelletyper fra iPSC’er til fremstilling af hjertemikrotiser. Denne lette replikastøbningsteknik tillader hjertemikrotissuekultur i standard multi-brøndcellekulturplader i flere uger. Platformen tillader brugerdefineret kontrol over mikrovævsstørrelser baseret på indledende såningstæthed og kræver mindre end 3 dage for selvmontering for at opnå observerbare hjertemikrovævskontraktioner. Desuden kan hjertemikrovævene let fordøjes, samtidig med at der opretholdes høj cellelevedygtighed til enkeltcelleforhør ved anvendelse af flowcytometri og enkeltcellet RNA-sekventering (scRNA-seq). Vi forestiller os, at denne in vitro-model af hjertemikrotiser vil hjælpe med at fremskynde valideringsstudier inden for lægemiddelopdagelse og sygdomsmodellering.
Introduction
Lægemiddelopdagelse og sygdomsmodellering inden for kardiovaskulær forskning står over for flere udfordringer på grund af mangel på klinisk relevante prøver og utilstrækkelige translationelle værktøjer1. Meget komplekse prækliniske modeller eller overforenklede in vitro-enkeltcellemodeller udviser ikke patofysiologiske tilstande på en reproducerbar måde. Derfor har flere miniaturiserede vævskonstruerede platforme udviklet sig til at hjælpe med at bygge bro over kløften med det formål at opnå en balance mellem brugervenlighed på en måde med høj gennemstrømning og trofast rekapitulation af vævsfunktion2,3. Med fremkomsten af induceret pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) kan vævstekniske værktøjer anvendes på patientspecifikke celler med eller uden underliggende kardiovaskulær sygdomstilstand for at besvare forskningsspørgsmål4,5,6. Sådanne vævskonstruerede modeller med cellulær sammensætning svarende til hjertevævet kunne anvendes i lægemiddeludviklingsindsatsen for at teste for kardiotoksicitet og dysfunktion induceret af patologiske ændringer i adfærd hos en eller flere celletyper.
Selvsamlede mikrovæv eller organoider afledt af humane iPSC’er er tredimensionelle (3D) strukturer, der er miniaturevævslignende samlinger, der udviser funktionelle ligheder med deres in vivo-modstykker . Der er flere forskellige tilgange, der tillader dannelse af organoider in situ via rettet differentiering af iPSC’er eller gennem dannelse af embryoide kroppe4. De resulterende organoider er et uundværligt redskab til at studere morfogenetiske processer, der driver organogenese. Tilstedeværelsen af en række cellepopulationer og forskelle i selvorganisering kan imidlertid føre til variation i resultaterne mellem forskellige organoider5. Alternativt er prædifferentierede celler, der er selvsamlet til mikrovævssuer med vævsspecifikke celletyper for at studere lokale celle-celleinteraktioner, fremragende modeller, hvor det er muligt at isolere de selvmonterede komponenter. Især inden for human hjerteforskning har udviklingen af 3D-hjertemikrovæv med flercellede komponenter vist sig at være udfordrende, når celler stammer fra forskellige patientlinjer eller kommercielle kilder.
For at forbedre vores mekanistiske forståelse af celleadfærd i en fysiologisk relevant, personlig in vitro-model bør ideelt set alle komponentcelletyper udledes af den samme patientlinje. I forbindelse med et menneskeligt hjerte ville en virkelig repræsentativ hjerte-in vitro-model fange krydstalen blandt fremherskende celletyper, nemlig kardiomyocytter (CM’er), endotelceller (EF’er) og hjertefibroblaster (CF’er) 6,7. Den trofaste rekapitulation af et myokardium kræver ikke kun biofysisk strækning og elektrofysiologisk stimulering, men også cellecellesignalering, der stammer fra understøttende celletyper som ECs og CFs8. GF’er er involveret i syntesen af ekstracellulær matrix og opretholdelse af vævsstruktur; og i en patologisk tilstand kan CF’er fremkalde fibrose og ændre elektrisk ledning i CMs9. På samme måde kan EU’er regulere kontraktile egenskaber ved PM’er gennem parakrin signalering og levering af vitale metaboliske krav10. Derfor er der behov for humane hjertemikrovæv, der består af alle tre hovedcelletyper, for at gøre det muligt at udføre fysiologisk relevante eksperimenter med høj kapacitet.
Her beskriver vi en bottom-up-tilgang til fremstilling af hjertemikrovæv ved afledning af humane iPSC-afledte kardiomyocytter (iPSC-CM’er), iPSC-afledte endotelceller (iPSC-EC’er) og iPSC-afledte hjertefibroblaster (iPSC-CF’er) og deres 3D-kultur i ensartede hjertemikrotissue-arrays. Denne letkøbte metode til at generere spontant slående hjertemikrovæv kan bruges til sygdomsmodellering og hurtig test af lægemidler til funktionel og mekanistisk forståelse af hjertefysiologi. Desuden kan sådanne multicellulære hjertemikrotissueplatforme udnyttes med genomredigeringsteknikker til at efterligne hjertesygdomsprogression over tid under kroniske eller akutte dyrkningsforhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at generere hjertemikrotiser fra prædifferentierede iPSC-PM’er, iPSC-EC’er og iPSC-CF’er er det vigtigt at opnå en meget ren kultur for bedre kontrol af cellenumre efter kontakthæmmet cellekomprimering inden for hjertemikrovævene. For nylig, Giacomelli et. al.18 har demonstreret fremstilling af hjertemikrotiser ved hjælp af iPSC-CM’er, iPSC-EC’er og iPSC-GF’er. Hjertemikroproblemer genereret ved hjælp af den beskrevne metode består af ~ 5.000 celler (70% iPSC-CM’er, 15% iPSC-EC’er og 15…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Amanda Chase for hendes nyttige feedback på manuskriptet. Finansieringsstøtte blev ydet af Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) fra University of California, T29FT0380 (D.T.) og 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) og 17MERIT33610009 (J.C.W.); og National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 og NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
Materials
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
References
- Neofytou, E., O’Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166 (2018).
- Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
- Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
- Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
- Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
- Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
- Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
- Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , 1-7 (2020).
- Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
- Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
- Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
- Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
- Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
- Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
- Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
- McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
- Thomas, D., O’Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).
- Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39 (2021).
- Rhee, J. -. W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).
- Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
- Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
- Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
- Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).
