Изготовление 3D-матриц микротизвестков сердца с использованием кардиомиоцитов человека, фибробластов сердца и эндотелиальных клеток
Summary
Здесь мы описываем простую в использовании методологию генерации 3D-самособранных сердечных микротизируемых массивов, состоящих из предварительно дифференцированных индуцированных человеком плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, сердечных фибробластов и эндотелиальных клеток. Этот удобный для пользователя и низкоклеточный метод, требующий генерации сердечных микротизов, может быть реализован для моделирования заболеваний и ранних стадий разработки лекарств.
Abstract
Генерация кардиомиоцитов человека (КМ), сердечных фибробластов (ХФ) и эндотелиальных клеток (ЭК) из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) предоставила уникальную возможность изучить сложное взаимодействие между различными типами сердечно-сосудистых клеток, которое стимулирует развитие тканей и заболевания. В области моделей сердечной ткани несколько сложных трехмерных (3D) подходов используют индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (iPSC-CMs), для имитации физиологической значимости и нативной тканевой среды с комбинацией внеклеточных матриц и сшивающихся веществ. Тем не менее, эти системы сложны для изготовления без опыта микропроизводства и требуют нескольких недель для самостоятельной сборки. Самое главное, что во многих из этих систем отсутствуют сосудистые клетки и сердечные фибробласты, которые составляют более 60% немиоцитов в сердце человека. Здесь мы описываем происхождение всех трех типов сердечных клеток из ИПСК для изготовления сердечных микротизов. Этот метод легкого формования реплик позволяет культивировать микротизируемость сердца в стандартных многоскважинных пластинах клеточных культур в течение нескольких недель. Платформа позволяет пользователю контролировать размеры микротизсу на основе начальной плотности посева и требует менее 3 дней для самостоятельной сборки для достижения наблюдаемых сокращений сердечной микротусовки. Кроме того, сердечные микроткани могут быть легко усваиваемы при сохранении высокой жизнеспособности клеток для одноклеточного опроса с использованием проточной цитометрии и секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq). Мы предполагаем, что эта модель микротизов сердца in vitro поможет ускорить валидационные исследования в области открытия лекарств и моделирования заболеваний.
Introduction
Открытие лекарств и моделирование заболеваний в области сердечно-сосудистых исследований сталкиваются с рядом проблем из-за отсутствия клинически значимых образцов и неадекватных трансляционных инструментов1. Очень сложные доклинические модели или чрезмерно упрощенные одноклеточные модели in vitro не демонстрируют патофизиологические условия воспроизводимым образом. Таким образом, несколько миниатюрных тканеинженерных платформ эволюционировали, чтобы помочь преодолеть разрыв с целью достижения баланса между простотой применения с высокой пропускной способностью и точным повторением функции ткани2,3. С появлением технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) инструменты тканевой инженерии могут быть применены к специфическим для пациента клеткам с или без основного состояния сердечно-сосудистых заболеваний, чтобы ответить на вопросы исследований4,5,6. Такие тканевые инженерные модели с клеточным составом, похожим на сердечную ткань, могут быть использованы в усилиях по разработке лекарств для проверки кардиотоксичности и дисфункции, вызванных патологическими изменениями в поведении одного или нескольких типов клеток.
Самосборные микроткани или органоиды, полученные из человеческих ИПСК, представляют собой трехмерные (3D) структуры, которые представляют собой миниатюрные тканеподобные сборки, демонстрирующие функциональное сходство со своими аналогами in vivo . Существует несколько различных подходов, которые позволяют формировать органоиды in situ посредством направленной дифференцировки иПСК или путем формирования эмбриоидных тел4. Полученные органоиды являются незаменимым инструментом для изучения морфогенетических процессов, которые управляют органогенезом. Однако наличие разнообразных клеточных популяций и различий в самоорганизации может привести к вариабельности исходов между различными органоидами5. В качестве альтернативы, предварительно дифференцированные клетки, которые самособираются в микроткани с тканеспецифическими типами клеток для изучения локальных клеточных взаимодействий, являются отличными моделями, где возможно изолировать самособранные компоненты. В частности, в исследованиях сердца человека разработка 3D-микротизов сердца с многоклеточными компонентами оказалась сложной задачей, когда клетки получены из разных линий пациентов или коммерческих источников.
Чтобы улучшить наше механистическое понимание поведения клеток в физиологически значимой, персонализированной модели in vitro, в идеале все составные типы клеток должны быть получены из одной и той же линии пациента. В контексте человеческого сердца действительно репрезентативная модель сердца in vitro будет захватывать перекрестные помехи между преобладающими типами клеток, а именно кардиомиоцитами (КМ), эндотелиальными клетками (ЕС) и сердечными фибробластами (ХФ)6,7. Точное повторение миокарда требует не только биофизического растяжения и электрофизиологической стимуляции, но и передачи сигналов клетками, которые возникают из поддерживающих типов клеток, таких как EC и CFs8. КФ участвуют в синтезе внеклеточного матрикса и поддержании структуры ткани; а в патологическом состоянии ХФ могут вызывать фиброз и изменять электрическую проводимость в CMs9. Аналогичным образом, ЭК могут регулировать сократительные свойства КМ посредством паракринной сигнализации и удовлетворения жизненно важных метаболических потребностей10. Следовательно, существует потребность в сердечных микротизюмах человека, состоящих из всех трех основных типов клеток, чтобы можно было проводить физиологически значимые эксперименты с высокой пропускной способностью.
Здесь мы описываем подход «снизу вверх» в изготовлении сердечных микротизов путем получения кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC (iPSC-CMs), эндотелиальных клеток, полученных из iPSC (iPSC-ECs), и сердечных фибробластов, полученных из iPSC (iPSC-CFs), и их 3D-культуры в однородных массивах сердечных микротизюй. Этот поверхностный метод генерации спонтанно бьющихся сердечных микротизюм может быть использован для моделирования заболеваний и быстрого тестирования лекарств для функционального и механистического понимания физиологии сердца. Кроме того, такие многоклеточные платформы сердечных микротизируемых состояний могут быть использованы с методами редактирования генома для имитации прогрессирования сердечных заболеваний с течением времени при хронических или острых условиях культивирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для генерации сердечных микротизов из предварительно дифференцированных iPSC-CMs, iPSC-ECs и iPSC-CFs важно получить высокочистую культуру для лучшего контроля количества клеток после контактно-ингибированного уплотнения клеток в сердечных микростипусах. Недавно Джакомелли и др. al.18</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Аманду Чейз за ее полезный отзыв о рукописи. Финансовая поддержка была предоставлена Программой исследований заболеваний, связанных с табаком (TRDRP) Калифорнийского университета, T29FT0380 (D.T.) и 27IR-0012 (J.C.W.); Американская кардиологическая ассоциация 20POST35210896 (H.K.) и 17MERIT33610009 (J.C.W.); и Национальные институты здравоохранения (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 и NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
Materials
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
References
- Neofytou, E., O’Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166 (2018).
- Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
- Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
- Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
- Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
- Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
- Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
- Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , 1-7 (2020).
- Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
- Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
- Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
- Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
- Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
- Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
- Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
- McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
- Thomas, D., O’Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).
- Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39 (2021).
- Rhee, J. -. W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).
- Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
- Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
- Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
- Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).
