Fabbricazione di array di microtissue cardiaci 3D utilizzando cardiomiociti derivati da iPSC umani, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali
Summary
Qui, descriviamo una metodologia facile da usare per generare array di microtessuti cardiaci auto-assemblati 3D composti da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti preseferenziate indotte dall’uomo, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali. Questa tecnica user-friendly e a bassa richiesta cellulare per generare microtessuti cardiaci può essere implementata per la modellazione della malattia e le prime fasi dello sviluppo del farmaco.
Abstract
La generazione di cardiomiociti umani (CM), fibroblasti cardiaci (CF) e cellule endoteliali (EC) da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ha fornito un’opportunità unica per studiare la complessa interazione tra diversi tipi di cellule cardiovascolari che guida lo sviluppo e la malattia dei tessuti. Nell’area dei modelli di tessuto cardiaco, diversi sofisticati approcci tridimensionali (3D) utilizzano cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC-CM) per imitare la rilevanza fisiologica e l’ambiente tissutale nativo con una combinazione di matrici extracellulari e reticolanti. Tuttavia, questi sistemi sono complessi da fabbricare senza competenze di microfabbricazione e richiedono diverse settimane per auto-assemblarsi. Ancora più importante, molti di questi sistemi mancano di cellule vascolari e fibroblasti cardiaci che costituiscono oltre il 60% dei non miociti nel cuore umano. Qui descriviamo la derivazione di tutti e tre i tipi di cellule cardiache dalle iPSC per fabbricare microtessuti cardiaci. Questa facile tecnica di stampaggio replica consente la coltura di microtessuti cardiaci in piastre di coltura cellulare multi-pozzo standard per diverse settimane. La piattaforma consente un controllo definito dall’utente sulle dimensioni delle microtissue in base alla densità iniziale di semina e richiede meno di 3 giorni per l’autoassemblaggio per ottenere contrazioni cardiache del microtissueo osservabili. Inoltre, i microtessuti cardiaci possono essere facilmente digeriti mantenendo un’elevata vitalità cellulare per l’interrogazione monocellulare con l’uso della citometria a flusso e del sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq). Prevediamo che questo modello in vitro di microtessuti cardiaci contribuirà ad accelerare gli studi di convalida nella scoperta di farmaci e nella modellazione delle malattie.
Introduction
La scoperta di farmaci e la modellazione delle malattie nel campo della ricerca cardiovascolare devono affrontare diverse sfide a causa della mancanza di campioni clinicamente rilevanti e di strumenti traslazionali inadeguati1. Modelli pre-clinici altamente complessi o modelli monocellulari in vitro troppo semplificati non presentano condizioni fisiopatologiche in modo riproducibile. Pertanto, diverse piattaforme miniaturizzate di ingegneria tissutale si sono evolute per contribuire a colmare il divario, con l’obiettivo di raggiungere un equilibrio tra facilità di applicazione in modo ad alta produttività e fedele ricapitolazione della funzione tissutale2,3. Con l’avvento della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), gli strumenti di ingegneria tissutale possono essere applicati a cellule specifiche del paziente con o senza stato di malattia cardiovascolare sottostante per rispondere alle domande di ricerca4,5,6. Tali modelli di ingegneria tissutale con composizione cellulare simile al tessuto cardiaco potrebbero essere utilizzati negli sforzi di sviluppo di farmaci per testare la cardiotossicità e la disfunzione indotte da cambiamenti patologici nel comportamento di uno o più tipi di cellule.
I microtessuti o organoidi autoassemblati derivati da iPSC umane sono strutture tridimensionali (3D) che sono assemblaggi simili a tessuti in miniatura che presentano somiglianze funzionali con le loro controparti in vivo. Esistono diversi approcci che consentono la formazione di organoidi in situ attraverso la differenziazione diretta di iPSC o attraverso la formazione di corpi embrioidi4. Gli organoidi risultanti sono uno strumento indispensabile per studiare i processi morfogenetici che guidano l’organogenesi. Tuttavia, la presenza di una varietà di popolazioni cellulari e le differenze nell’auto-organizzazione possono portare a variabilità nei risultati tra diversi organoidi5. In alternativa, le cellule prese differenziate che sono auto-assemblate in microtessuti con tipi di cellule tessuto-specifiche per studiare le interazioni cellula-cellula locali sono modelli eccellenti, in cui è possibile isolare i componenti autoassemblati. In particolare nella ricerca cardiaca umana, lo sviluppo di microtessuti cardiaci 3D con componenti multicellulari si è dimostrato impegnativo quando le cellule sono derivate da diverse linee di pazienti o fonti commerciali.
Per migliorare la nostra comprensione meccanicistica dei comportamenti cellulari in un modello fisiologicamente rilevante, personalizzato, in vitro, idealmente tutti i tipi di cellule componenti dovrebbero essere derivati dalla stessa linea di pazienti. Nel contesto di un cuore umano, un modello cardiaco in vitro veramente rappresentativo catturerebbe la diafonia tra i tipi di cellule predominanti, vale a dire, cardiomiociti (CM), cellule endoteliali (EC) e fibroblasti cardiaci (CF)6,7. La ricapitolazione fedele di un miocardio non richiede solo un allungamento biofisico e una stimolazione elettrofisiologica, ma anche la segnalazione cellula-cellula che deriva da tipi di cellule di supporto come EC e CF8. I CF sono coinvolti nella sintesi della matrice extracellulare e nel mantenimento della struttura tissutale; e in uno stato patologico, i CF possono indurre fibrosi e alterare la conduzione elettrica nei CM9. Allo stesso modo, le CE possono regolare le proprietà contrattili delle CM attraverso la segnalazione paracrina e fornendo richieste metaboliche vitali10. Quindi, c’è bisogno di microtessuti cardiaci umani composti da tutti e tre i principali tipi di cellule per consentire di condurre esperimenti ad alto rendimento fisiologicamente rilevanti.
Qui, descriviamo un approccio bottom-up nella fabbricazione di microtissue cardiaci per derivazione di cardiomiociti umani derivati da iPSC (iPSC-CM), cellule endoteliali derivate da iPSC (iPSC-EC) e fibroblasti cardiaci derivati da iPSC (iPSC-CF) e la loro coltura 3D in array di microtissue cardiaci uniformi. Questo facile metodo di generazione di microtessuti cardiaci che battono spontaneamente può essere utilizzato per la modellazione della malattia e la sperimentazione rapida di farmaci per la comprensione funzionale e meccanicistica della fisiologia cardiaca. Inoltre, tali piattaforme di microtessuto cardiaco multicellulare potrebbero essere sfruttate con tecniche di editing del genoma per emulare la progressione della malattia cardiaca nel tempo in condizioni di coltura cronica o acuta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per generare microtessuti cardiaci da iPSC-CM pres differenziati, iPSC-EC e iPSC-CF, è essenziale ottenere una coltura altamente pura per un migliore controllo del numero di cellule dopo la compattazione cellulare inibita dal contatto all’interno dei microtessuti cardiaci. Recentemente, Giacomelli et. al.18 hanno dimostrato la fabbricazione di microtissue cardiaci utilizzando iPSC-CM, iPSC-EC e iPSC-CF. I microsessu cardiaci generati utilizzando il metodo descritto sono costituiti da ~ 5.000 cell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la dottoressa Amanda Chase per il suo utile feedback sul manoscritto. Il sostegno finanziario è stato fornito dal Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) dell’Università della California, T29FT0380 (D.T.) e 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) e 17MERIT33610009 (J.C.W.); e National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 e NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
Materials
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
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