मानव iPSC-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स, कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग करके 3 डी कार्डियक माइक्रोटिश्यू सरणियों का निर्माण
Summary
यहां, हम 3 डी स्व-इकट्ठे कार्डियक माइक्रोटिश्यू सरणियों को उत्पन्न करने के लिए एक आसान-से-उपयोग पद्धति का वर्णन करते हैं जो पूर्व-विभेदित मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स, कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं से बना है। कार्डियक माइक्रोटिस्यूज उत्पन्न करने के लिए तकनीक की आवश्यकता वाले इस उपयोगकर्ता के अनुकूल और कम सेल को रोग मॉडलिंग और दवा के विकास के शुरुआती चरणों के लिए लागू किया जा सकता है।
Abstract
प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (आईपीएससी) से मानव कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम), कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएफ), और एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) की पीढ़ी ने विभिन्न कार्डियोवैस्कुलर सेल प्रकारों के बीच जटिल इंटरप्ले का अध्ययन करने का एक अनूठा अवसर प्रदान किया है जो ऊतक विकास और बीमारी को चलाता है। कार्डियक ऊतक मॉडल के क्षेत्र में, कई परिष्कृत तीन आयामी (3 डी) दृष्टिकोण प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) का उपयोग करते हैं ताकि शारीरिक प्रासंगिकता और देशी ऊतक वातावरण की नकल की जा सके, जो बाहरी मैट्रिक्स और क्रॉसलिंकर्स के संयोजन के साथ होता है। हालांकि, ये प्रणालियां माइक्रोफैब्रिकेशन विशेषज्ञता के बिना बनाने के लिए जटिल हैं और आत्म-इकट्ठा करने के लिए कई हफ्तों की आवश्यकता होती है। सबसे महत्वपूर्ण बात, इनमें से कई प्रणालियों में संवहनी कोशिकाओं और कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स की कमी होती है जो मानव हृदय में 60% से अधिक गैर-मायोसाइट्स बनाते हैं। यहां हम आईपीएससी से कार्डियक माइक्रोटिस्यू बनाने के लिए सभी तीन कार्डियक सेल प्रकारों की व्युत्पत्ति का वर्णन करते हैं। यह सरल प्रतिकृति मोल्डिंग तकनीक कई हफ्तों के लिए मानक बहु-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों में कार्डियक माइक्रोटिश्यू संस्कृति की अनुमति देती है। प्लेटफ़ॉर्म प्रारंभिक सीडिंग घनत्व के आधार पर माइक्रोटिश्यू आकारों पर उपयोगकर्ता-परिभाषित नियंत्रण की अनुमति देता है और अवलोकन योग्य कार्डियक माइक्रोटिश्यू संकुचन प्राप्त करने के लिए आत्म-असेंबली के लिए 3 दिनों से भी कम समय की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, प्रवाह साइटोमेट्री और एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण (एससीआरएनए-सेक) के उपयोग के साथ एकल-सेल पूछताछ के लिए उच्च सेल व्यवहार्यता को बनाए रखते हुए कार्डियक माइक्रोटिस्यू को आसानी से पचाया जा सकता है। हम कल्पना करते हैं कि कार्डियक माइक्रोटिश्यूज़ का यह इन विट्रो मॉडल दवा की खोज और रोग मॉडलिंग में सत्यापन अध्ययन में तेजी लाने में मदद करेगा।
Introduction
कार्डियोवैस्कुलर अनुसंधान के क्षेत्र में दवा की खोज और रोग मॉडलिंग को नैदानिक रूप से प्रासंगिक नमूनों और अपर्याप्त ट्रांसलेशनल टूल्स 1 की कमी के कारण कई चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। अत्यधिक जटिल पूर्व-नैदानिक मॉडल या विट्रो एकल-सेल मॉडल में अतिसरलीकृत एक पुनरुत्पादक तरीके से pathophysiological स्थितियों का प्रदर्शन नहीं करते हैं। इसलिए, कई लघुकृत ऊतक-इंजीनियर प्लेटफ़ॉर्म अंतर को पाटने में मदद करने के लिए विकसित हुए हैं, एक उच्च-थ्रूपुट तरीके से आवेदन में आसानी और ऊतक फ़ंक्शन 2,3 के वफादार पुनरावृत्ति के बीच संतुलन प्राप्त करने के लक्ष्य के साथ। प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) प्रौद्योगिकी के आगमन के साथ, ऊतक इंजीनियरिंग उपकरणों को अनुसंधान प्रश्नों का उत्तर देने के लिए अंतर्निहित हृदय रोग राज्य के साथ या बिना रोगी-विशिष्ट कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है4,5,6। हृदय के ऊतकों के समान सेलुलर संरचना के साथ इस तरह के ऊतक इंजीनियर मॉडल का उपयोग एक या कई सेल प्रकारों के व्यवहार में रोग संबंधी परिवर्तनों से प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी और शिथिलता के लिए परीक्षण करने के लिए दवा विकास प्रयासों में किया जा सकता है।
मानव आईपीएससी से व्युत्पन्न स्व-इकट्ठे माइक्रोटिस्यू या ऑर्गेनोइड्स तीन-आयामी (3 डी) संरचनाएं हैं जो लघु ऊतक जैसी असेंबली हैं जो उनके इन विवो समकक्षों के लिए कार्यात्मक समानताएं प्रदर्शित करती हैं। कई अलग-अलग दृष्टिकोण हैं जो आईपीएससी के निर्देशित भेदभाव के माध्यम से या भ्रूणीय निकायों के गठन के माध्यम से सीटू में ऑर्गेनोइड्स के गठन की अनुमति देते हैं। परिणामी ऑर्गेनोइड्स ऑर्गोजेनेटिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक अपरिहार्य उपकरण है जो ऑर्गेनोजेनेसिस को चलाता है। हालांकि, विभिन्न प्रकार की कोशिका आबादी की उपस्थिति और स्व-संगठन में अंतर विभिन्न ऑर्गेनोइड्स 5 के बीच परिणामों में परिवर्तनशीलता का कारण बन सकता है। वैकल्पिक रूप से, पूर्व-विभेदित कोशिकाएं जो स्थानीय सेल-सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए ऊतक-विशिष्ट सेल प्रकारों के साथ माइक्रोटिस में स्वयं-इकट्ठी होती हैं, उत्कृष्ट मॉडल हैं, जहां स्व-इकट्ठे घटकों को अलग करना संभव है। विशेष रूप से मानव कार्डियक अनुसंधान में, बहुकोशिकीय घटकों के साथ 3 डी कार्डियक माइक्रोटिस्यूज़ का विकास चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है जब कोशिकाएं विभिन्न रोगी लाइनों या वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त होती हैं।
एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक, व्यक्तिगत, इन विट्रो मॉडल में सेल व्यवहार की हमारी यांत्रिक समझ में सुधार करने के लिए, आदर्श रूप से सभी घटक सेल प्रकारों को एक ही रोगी लाइन से प्राप्त किया जाना चाहिए। मानव हृदय के संदर्भ में, वास्तव में एक प्रतिनिधि कार्डियक इन विट्रो मॉडल प्रमुख सेल प्रकारों के बीच क्रॉसस्टॉक पर कब्जा कर लेगा, अर्थात्, कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम), एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी), और कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएफ) 6,7। मायोकार्डियम के वफादार पुनरावृत्ति के लिए न केवल बायोफिजिकल खिंचाव और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल उत्तेजना की आवश्यकता होती है, बल्कि सेल-सेल सिग्नलिंग भी होती है जो ईसी और सीएफ 8 जैसे सेल प्रकारों का समर्थन करने से उत्पन्न होती है। CFs extracellular मैट्रिक्स के संश्लेषण और ऊतक संरचना को बनाए रखने में शामिल हैं; और एक पैथोलॉजिकल स्थिति में, CFs फाइब्रोसिस को प्रेरित कर सकते हैं और CMs9 में विद्युत चालन को बदल सकते हैं। इसी तरह, ईसी पैराक्राइन सिग्नलिंग के माध्यम से सीएम के संकुचनशील गुणों को विनियमित कर सकते हैं और महत्वपूर्ण चयापचय मांगों की आपूर्ति कर सकते हैं। इसलिए, शारीरिक रूप से प्रासंगिक उच्च-थ्रूपुट प्रयोगों को आयोजित करने की अनुमति देने के लिए सभी तीन प्रमुख सेल प्रकारों से बने मानव कार्डियक माइक्रोटिस्यूस की आवश्यकता है।
यहां, हम मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम), आईपीएससी-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं (आईपीएससी-ईसी), और आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स (आईपीएससी-सीएफ) और समान कार्डियक माइक्रोटिश्यू सरणियों में उनकी 3 डी संस्कृति की व्युत्पत्ति द्वारा कार्डियक माइक्रोटिसस के निर्माण में एक बॉटम-अप दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। अनायास धड़कते हुए कार्डियक माइक्रोटिस्यूज़ उत्पन्न करने की इस सरल विधि का उपयोग रोग मॉडलिंग और हृदय शरीर विज्ञान की कार्यात्मक और यांत्रिक समझ के लिए दवाओं के तेजी से परीक्षण के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इस तरह के बहुकोशिकीय कार्डियक माइक्रोटिश्यू प्लेटफार्मों को जीनोम संपादन तकनीकों के साथ शोषण किया जा सकता है ताकि पुरानी या तीव्र संस्कृति स्थितियों के तहत समय के साथ हृदय रोग की प्रगति का अनुकरण किया जा सके।
Protocol
Representative Results
Discussion
पूर्व-विभेदित आईपीएससी-सीएम, आईपीएससी-ईसी, और आईपीएससी-सीएफ से कार्डियक माइक्रोटिसस उत्पन्न करने के लिए, कार्डियक माइक्रोटिस्यू के भीतर संपर्क-बाधित सेल संघनन के बाद सेल नंबरों के बेहतर नियंत्रण के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि पर उनकी उपयोगी प्रतिक्रिया के लिए डॉ अमांडा चेस को धन्यवाद देते हैं। वित्त पोषण सहायता कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय के तम्बाकू से संबंधित रोग अनुसंधान कार्यक्रम (TRDRP), T29FT0380 (D.T.) और 27IR-0012 (J.C.W.) द्वारा प्रदान की गई थी; अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 20POST35210896 (H.K.) और 17MERIT33610009 (J.C.W.); और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851, और NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
Materials
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
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