Fabrikasjon av 3D cardiac microtissue arrays ved hjelp av humane iPSC-avledede kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller
Summary
Her beskriver vi en brukervennlig metodikk for å generere 3D-selvmonterte hjertemikrotissuekjeder sammensatt av pre-differensierte menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller. Denne brukervennlige og lave cellen som krever teknikk for å generere hjertemikroser kan implementeres for sykdomsmodellering og tidlige stadier av narkotikautvikling.
Abstract
Generering av humane kardiomyocytter (CMs), hjertefibroblaster (CFer) og endotelceller (ECs) fra induserte pluripotente stamceller (iPSCer) har gitt en unik mulighet til å studere det komplekse samspillet mellom forskjellige kardiovaskulære celletyper som driver vevsutvikling og sykdom. Innen hjertevevsmodeller bruker flere sofistikerte tredimensjonale (3D) tilnærminger indusert pluripotent stamcelleavledede kardiomyocytter (iPSC-CMs) for å etterligne fysiologisk relevans og innfødt vevsmiljø med en kombinasjon av ekstracellulære matriser og krysskoblinger. Imidlertid er disse systemene komplekse å fremstille uten mikrofabrikasjonskompetanse og krever flere uker å montere seg selv. Viktigst av alt mangler mange av disse systemene vaskulære celler og hjertefibroblaster som utgjør over 60% av de ikke-fyocyttene i menneskehjertet. Her beskriver vi avledningen av alle tre hjertecelletyper fra iPSC til fabrikat hjertemikrotissues. Denne facile kopi molding teknikken tillater hjerte mikrotissue kultur i standard multi-brønn celle kultur plater i flere uker. Plattformen tillater brukerdefinert kontroll over mikrotissestørrelser basert på innledende såddtetthet og krever mindre enn 3 dager for selvmontering for å oppnå observerbare hjertemikrotissuekontraksjoner. Videre kan hjertemikrotissuene lett fordøyes samtidig som høy celle levedyktighet for encellet forhør med bruk av strømningscytometri og encellet RNA-sekvensering (scRNA-seq). Vi ser for oss at denne in vitro-modellen av hjertemikroter vil bidra til å akselerere valideringsstudier i legemiddeloppdagelse og sykdomsmodellering.
Introduction
Legemiddeloppdagelse og sykdomsmodellering innen kardiovaskulær forskning står overfor flere utfordringer på grunn av mangel på klinisk relevante prøver og utilstrekkelige translasjonsverktøy1. Svært komplekse prekliniske modeller eller forenklede in vitro encellede modeller viser ikke patofysiologiske forhold på en reproduserbar måte. Derfor har flere miniatyriserte vevskonstruerte plattformer utviklet seg for å bidra til å bygge bro over gapet, med mål om å oppnå en balanse mellom brukervennlighet på en høy gjennomstrømningsmåte og trofast recapitulation av vevsfunksjon2,3. Med ankomsten av indusert pluripotent stamcelle (iPSC) teknologi, vev engineering verktøy kan brukes på pasientspesifikke celler med eller uten underliggende kardiovaskulær sykdom tilstand for å svare på forskningsspørsmål4,5,6. Slike vevskonstruerte modeller med cellulær sammensetning som ligner hjertevevet, kan brukes i narkotikautviklingsarbeidet for å teste for kardiotoksisitet og dysfunksjon forårsaket av patologiske endringer i oppførselen til en eller flere celletyper.
Selvmonterte mikrotissuer eller organoider avledet fra menneskelige iPSCer er tredimensjonale (3D) strukturer som er miniatyrvevlignende forsamlinger som viser funksjonelle likheter med sine in vivo-kolleger . Det finnes flere forskjellige tilnærminger som tillater dannelse av organoider in situ via rettet differensiering av iPSC eller gjennom dannelsen av embryoide legemer4. De resulterende organoidene er et uunnværlig verktøy for å studere morfogenetiske prosesser som driver organogenese. Tilstedeværelsen av en rekke cellepopulasjoner og forskjeller i selvorganisering kan imidlertid føre til variasjon i resultatene mellom forskjellige organoider5. Alternativt er forhåndsdifferensierte celler som er selvmontert i mikrobehov med vevsspesifikke celletyper for å studere lokale cellecelleinteraksjoner gode modeller, der det er mulig å isolere de selvmonterte komponentene. Spesielt i menneskelig hjerteforskning har utvikling av 3D-hjertemikrobehov med multicellulære komponenter vist seg å være utfordrende når celler er avledet fra forskjellige pasientlinjer eller kommersielle kilder.
For å forbedre vår mekanistiske forståelse av celleatferd i en fysiologisk relevant, personlig, in vitro-modell, bør ideelt sett alle komponentcelletyper avledes fra samme pasientlinje. I sammenheng med et menneskehjerte ville en virkelig representativ hjerteintromodell fange krysstale blant dominerende celletyper, nemlig kardiomyocytter (CMs), endotelceller (ECs) og hjertefibroblaster (CFs) 6,7. Den trofaste recapitulation av et myokardi krever ikke bare biofysisk strekk og elektrofysiologisk stimulering, men også cellecellesignalering som oppstår fra støttende celletyper som ECs og CFs8. CFer er involvert i syntesen av ekstracellulær matrise og opprettholde vevsstruktur; og i en patologisk tilstand kan CFer indusere fibrose og endre elektrisk ledning i CMs9. På samme måte kan ECer regulere kontraktilegenskaper til CMs gjennom parakrinesignalering og levering av vitale metabolske krav10. Derfor er det behov for menneskelige hjertemikrobehov som består av alle de tre hovedcelletypene for å tillate fysiologisk relevante høygjennomstrømningseksperimenter.
Her beskriver vi en nedenfra-og-opp-tilnærming i fabrikasjon av hjertemikroter ved avledning av humane iPSC-avledede kardiomyocytter (iPSC-CMs), iPSC-avledede endotelceller (iPSC-OKKER) og iPSC-avledede hjertefibroblaster (iPSC-CFer) og deres 3D-kultur i ensartede hjertemikrotissyndematriser. Denne facile metoden for å generere spontant slå hjertemikrotissues kan brukes til sykdomsmodellering og rask testing av legemidler for funksjonell og mekanistisk forståelse av hjertefysiologi. Videre kan slike multicellulære hjertemikrotissueplattformer utnyttes med genomredigeringsteknikker for å etterligne hjertesykdomsprogresjon over tid under kroniske eller akutte kulturforhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å generere hjertemikrobrikker fra forhåndsdifferensierte iPSC-CMer, iPSC-OKKER og iPSC-CFer, er det viktig å få en svært ren kultur for bedre kontroll av cellenumre etter kontakthemmet cellekomprimering i hjertemikrotissuene. Nylig, Giacomelli et. al.18 har demonstrert fabrikasjonen av hjertemikroter ved hjelp av iPSC-CMer, iPSC-OKKER og iPSC-CFer. Hjertemikroser som genereres ved hjelp av den beskrevne metoden, består av ~5000 celler (70 % iPSC-CMer, 15 % iPSC-ECer og 15 % iPSC-CFer). I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Amanda Chase for hennes nyttige tilbakemelding på manuskriptet. Finansieringsstøtte ble gitt av Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) ved University of California, T29FT0380 (D.T.) og 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) og 17MERIT33610009 (J.C.W.); og National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 og NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
Materials
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
References
- Neofytou, E., O’Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166 (2018).
- Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
- Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
- Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
- Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
- Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
- Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
- Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , 1-7 (2020).
- Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
- Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
- Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
- Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
- Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
- Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
- Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
- McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
- Thomas, D., O’Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).
- Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39 (2021).
- Rhee, J. -. W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).
- Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
- Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
- Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
- Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).
