Tillverkning av 3D Cardiac Microtissue Arrays med mänskliga iPSC-härledda kardiomyocyter, hjärtfibblaster och endotelceller
Summary
Här beskriver vi en lättanvänd metodik för att generera 3D självmonterade hjärt microtissue matriser bestående av fördifferentierade mänskliga-inducerad pluripotenta stamcell-härledda cardiomyocytes, hjärt fibroblaster och endotel celler. Denna användarvänliga och låga cell som kräver teknik för att generera hjärtmikrotissuer kan implementeras för sjukdomsmodellering och tidiga stadier av läkemedelsutveckling.
Abstract
Generering av mänskliga kardiomyocyter (CMs), hjärtfibblaster (CFs) och endotelceller (ECs) från inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har gett en unik möjlighet att studera det komplexa samspelet mellan olika kardiovaskulära celltyper som driver vävnadsutveckling och sjukdom. Inom området hjärt vävnad modeller, flera sofistikerade tredimensionella (3D) metoder använda inducerad pluripotent stamcell-härledda cardiomyocytes (iPSC-CMs) för att efterlikna fysiologisk relevans och inhemska vävnad miljö med en kombination av extracellulära matriser och crosslinkers. Dessa system är dock komplexa att tillverka utan mikrotillverkningsexpertis och kräver flera veckor för att självmontera. Viktigast av allt saknar många av dessa system kärlceller och hjärtfibblaster som utgör över 60% av nonmyocyterna i det mänskliga hjärtat. Här beskriver vi härledning av alla tre hjärt cell typer från iPSCs att tillverka hjärt microtissues. Denna fakila replika formning teknik tillåter hjärt microtissue kultur i standard multi-well cell kultur plattor i flera veckor. Plattformen tillåter användardefinierad kontroll över mikrotissuestorlekar baserat på initial sådddensitet och kräver mindre än 3 dagar för självmontering för att uppnå observerbara hjärtmikrotissukontraktioner. Dessutom kan hjärtmikrotissuerna lätt smältas samtidigt som hög cellviabilitet för encellsförhör upprätthålls med hjälp av flödescytometri och encellig RNA-sekvensering (scRNA-seq). Vi föreställer oss att denna in vitro-modell av hjärtmikrotissuer kommer att bidra till att påskynda valideringsstudier inom läkemedelsupptäckt och sjukdomsmodellering.
Introduction
Läkemedelsupptäckt och sjukdomsmodellering inom kardiovaskulär forskning står inför flera utmaningar på grund av brist på kliniskt relevanta prover och otillräckliga translationella verktyg1. Mycket komplexa prekliniska modeller eller alltför förenklade in vitro encelliga modeller uppvisar inte patofysiologiska villkor på ett reproducerbart sätt. Därför har flera miniatyriserade vävnadskonstruerade plattformar utvecklats för att hjälpa till att överbrygga klyftan, med målet att uppnå en balans mellan enkel applicering på ett sätt med hög genomströmning och trogen rekapitulering av vävnadsfunktionen2,3. Med tillkomsten av inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) kan vävnadsteknikverktyg tillämpas på patientspecifika celler med eller utan underliggande kardiovaskulärt tillstånd för att svara på forskningsfrågor4,5,6. Sådana vävnad konstruerade modeller med cellulär sammansättning som liknar hjärtvävnaden kan användas i läkemedelsutvecklingsinsatser för att testa för kardiotoxicitet och dysfunktion inducerad av patologiska förändringar i beteendet hos en eller flera celltyper.
Självmonterade mikrotissuer eller organoider som härrör från mänskliga iPSCs är tredimensionella (3D) strukturer som är miniatyrvävnadsliknande sammansättningar som uppvisar funktionella likheter med deras in vivo-motsvarigheter. Det finns flera olika tillvägagångssätt som tillåter bildandet av organoider in situ via riktad differentiering av iPSCs eller genom bildandet av embryoidkroppar4. De resulterande organoiderna är ett oumbärligt verktyg för att studera morfogenetiska processer som driver organogenes. Förekomsten av en mängd olika cellpopulationer och skillnader i självorganisering kan dock leda till variationer i resultaten mellan olika organoider5. Alternativt är fördifferentierade celler som är självmonterade i mikrotissuer med vävnadsspecifika celltyper för att studera lokala cell-cellinteraktioner utmärkta modeller, där det är möjligt att isolera de självmonterade komponenterna. Särskilt inom mänsklig hjärtforskning har utvecklingen av 3D-hjärtmikrotissuer med multicellulära komponenter visat sig vara utmanande när celler härrör från olika patientlinjer eller kommersiella källor.
För att förbättra vår mekanistiska förståelse av cellbeteenden i en fysiologiskt relevant, personlig, in vitro-modell, bör helst alla komponentcelltyper härledas från samma patientlinje. I samband med ett mänskligt hjärta skulle en verkligt representativ hjärt in vitro-modell fånga korstalken bland dominerande celltyper, nämligen kardiomyocyter (CMs), endotelceller (ECs) och hjärtfibriller (CFs)6,7. Den trogna rekapitulationen av ett myokardi kräver inte bara biofysisk sträckning och elektrofysiologisk stimulering, utan även cellcellssignalering som uppstår från stödjande celltyper som ECs och CFs8. CFs är involverade i syntesen av extracellulär matris och upprätthållande vävnad struktur; och i ett patologiskt tillstånd kan CFs inducera fibros och ändra elektrisk ledning i CMs9. På samma sätt kan ECs reglera kontraktila egenskaper hos CMs genom parakrina signalering och leverera viktiga metaboliska krav10. Därför finns det ett behov av mänskliga hjärtmikrotissuer som består av alla tre huvudcelltyper för att tillåta fysiologiskt relevanta experiment med hög genomströmning.
Här beskriver vi en bottom-up strategi i tillverkning av hjärt microtissues genom härledning av mänskliga iPSC-härledda kardiomyocyter (iPSC-CMs), iPSC-härledda endotel celler (iPSC-ECs) och iPSC-härledda hjärt fibroblaster (iPSC-CFs) och deras 3D-kultur i enhetliga hjärt microtissue matriser. Denna enkla metod för att generera spontant slå hjärtmikrotissues kan användas för sjukdomsmodellering och snabb testning av läkemedel för funktionell och mekanistisk förståelse av hjärtfysiologi. Dessutom kan sådana multicellulära hjärtmikrotissueplattformar utnyttjas med genomredigeringstekniker för att efterlikna hjärtsjukdomsprogression över tid under kroniska eller akuta odlingsförhållanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att generera hjärtmikrotissuer från fördifferentierade iPSC-CMs, iPSC-ECs och iPSC-CFs, är det viktigt att få en mycket ren kultur för bättre kontroll av cellnummer efter kontakt-hämmad cellkomprimering inom hjärtmikrotissuerna. Nyligen, Giacomelli et. al.18 har visat tillverkning av hjärtmikrotissuer med hjälp av iPSC-CMs, iPSC-ECs och iPSC-CFs. Hjärtmikrotissuer som genereras med den beskrivna metoden består av ~5 000 celler (70% iPSC-CMs, 15% iPSC-ECs och 15% iPSC-CFs). I denn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar dr Amanda Chase för hennes hjälpsamma feedback på manuskriptet. Finansieringsstöd tillhandahölls av tobaksrelaterat sjukdomsforskningsprogram (TRDRP) vid University of California, T29FT0380 (D.T.) och 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) och 17MERIT33610009 (J.C.W.); och Nationella hälsoinstitut (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 och NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
Materials
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
References
- Neofytou, E., O’Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166 (2018).
- Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
- Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
- Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
- Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
- Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
- Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
- Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , 1-7 (2020).
- Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
- Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
- Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
- Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
- Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
- Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
- Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
- McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
- Thomas, D., O’Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).
- Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39 (2021).
- Rhee, J. -. W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).
- Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
- Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
- Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
- Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).
