कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स को सह-इंजेक्ट करने और समय के साथ ट्यूमर के विकास की निगरानी करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग ट्यूमर के विकास के नियामकों के रूप में फाइब्रोब्लास्ट की भूमिका के लिए आणविक आधार को समझने के लिए किया जा सकता है।
कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) ट्यूमर को बढ़ावा देने वाले माइक्रोएन्वायरमेंट बनाकर ट्यूमर के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं। ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में सीएएफ की भूमिका का अध्ययन करने के लिए मॉडल फाइब्रोब्लास्ट, विभिन्न ऊतकों से फाइब्रोब्लास्ट और फाइब्रोब्लास्ट में विशिष्ट आनुवंशिक कारकों के कार्यात्मक महत्व को समझने के लिए सहायक हो सकते हैं। माउस मॉडल विवो संदर्भ में ट्यूमर के विकास और प्रगति के योगदानकर्ताओं को समझने के लिए आवश्यक हैं। यहां, एक प्रोटोकॉल जिसमें कैंसर कोशिकाओं को फाइब्रोब्लास्ट के साथ मिलाया जाता है और ट्यूमर विकसित करने के लिए चूहों में पेश किया जाता है। समय के साथ ट्यूमर के आकार और अंतिम ट्यूमर वजन निर्धारित किए जाते हैं और समूहों के बीच तुलना की जाती है। वर्णित प्रोटोकॉल ट्यूमर के विकास और प्रगति में सीएएफ की कार्यात्मक भूमिका में अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।
ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर, सबसे प्रमुख सेल प्रकार में से एक कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) 1 है। ये कार्सिनोमा से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट ट्यूमर-दमनकारी भूमिका निभा सकते हैं 2,3. उदाहरण के लिए, एस 100 ए-व्यक्त फाइब्रोब्लास्ट कोलेजन का स्राव करते हैं जो कार्सिनोजेन्स को समाहित कर सकते हैं और कार्सिनोमा गठनसे बचा सकते हैं। इसके अलावा, अग्नाशय के कैंसर में α-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए) पॉजिटिव मायोफाइब्रोब्लास्ट की कमी इम्यूनोसप्रेशन का कारण बनती है और अग्नाशयके कैंसर की प्रगति में तेजी लाती है। सीएएफ कैंसर कोशिकाओं के साथ सह-विकसित हो सकते हैं और ट्यूमर की प्रगति 5,6,7,8 को बढ़ावा दे सकते हैं। फाइब्रोब्लास्ट बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन को संश्लेषित और स्रावित कर सकते हैं जो ट्यूमर को बढ़ावा देने वाला वातावरण बनातेहैं। ये बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन ऊतक की यांत्रिक कठोरता का कारण बन सकते हैं, जो ट्यूमर की प्रगति 9,10 से जुड़ा हुआ है। जमा बाह्य मैट्रिक्स एक भौतिक बाधा के रूप में कार्य कर सकता है जो प्रतिरक्षा घुसपैठ को रोकता है11. सीएएफ द्वारा मैट्रिक्स जमाव को ट्यूमर आक्रमण के साथ भी जोड़ा गया है क्योंकि सीएएफ द्वारा उत्पन्न फाइब्रोनेक्टिन को ट्यूमर आक्रमणको बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है। सीएएफ एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देते हैं और विकास कारक-β (टीजीएफ-β), संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ), इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6), और सीएक्ससी-केमोकाइन लिगैंड 12 (आईएक्ससीएल 12) 13,14,15 को स्रावित करके ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में इम्यूनोसप्रेसिव कोशिकाओं की भर्ती करते हैं। ट्यूमर के विकास को बढ़ावा देने में उनकी केंद्रीय भूमिका के कारण, कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्टकैंसर-विरोधी चिकित्सा 6,16,17,18 के लिए एक उभरते हुए लक्ष्य हैं।
नीचे दिया गया प्रोटोकॉल परीक्षण के लिए एक विधि का वर्णन करता है कि फाइब्रोब्लास्ट ट्यूमर के विकास के एक अच्छी तरह से स्थापित और व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले माउस मॉडल में ट्यूमर के विकास को कैसे प्रभावित करते हैं। ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में फाइब्रोब्लास्ट के महत्व को समझने के लिए, कैंसर कोशिकाओं को उनके विकास की निगरानी के लिए चूहों में पेश करने के लिए मानक प्रोटोकॉल को कैंसर सेल परिचय के साथ फाइब्रोब्लास्ट को शामिल करने के लिए संशोधित किया गया था। कैंसर कोशिकाओं को चमड़े के नीचे या इंट्राडर्मल रूप से पेश किया जा सकता है। इंट्राडर्मल परिचय के परिणामस्वरूप ट्यूमर होगा जो त्वचा से ही उत्पन्न होता है। जेनोग्राफ्ट्स जिसमें कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स को चूहों में सह-इंजेक्शन दिया जाता है,कैंसर के विकास को बढ़ावा देने की क्षमता में फाइब्रोब्लास्ट, फाइब्रोब्लास्ट ्स की उप-आबादी और प्रोटीन कारकों की भूमिका को विच्छेदित करने के लिए एक महत्वपूर्ण पद्धतिगत उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। चूहों में कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट के सह-इंजेक्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। इस विधि का उपयोग फाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति या अनुपस्थिति की तुलना करने के लिए किया जा सकता है, विभिन्न स्रोतों से फाइब्रोब्लास्ट की तुलना करने के लिए20, या विशिष्ट प्रोटीन19 की अभिव्यक्ति के साथ और बिना फाइब्रोब्लास्ट की तुलना करने के लिए। कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट पेश किए जाने के बाद, ट्यूमर के आकार की निगरानी समय के साथ की जा सकती है। प्रयोगों के अंत में, ट्यूमर को विच्छेदित और तौला जा सकता है। समय के साथ ट्यूमर के विकास की निगरानी करके, विभिन्न कारकों के महत्व को विच्छेदित किया जा सकता है।
ट्यूमर के विकास में फाइब्रोब्लास्ट की भूमिका का अध्ययन करने के लिए संभावित वैकल्पिक दृष्टिकोण हैं। एक उदाहरण के रूप में, क्रे-लॉक्स्ड आधारित मॉडल हैं जो फाइब्रोब्लास्ट में अधिमान्य रूप से व्यक्त ड्राइवरों के साथ जीन के ऊतक-विशिष्ट नॉकआउट प्रदान करते हैं। इस तरह के दृष्टिकोण ट्यूमर की प्रगति के लिए फाइब्रोब्लास्ट में विशिष्ट जीन और मार्गों की भूमिका की जांच करने के अवसर भी प्रदान करते हैं। क्रे-लॉक्स-आधारित दृष्टिकोणों की तुलना में, प्रदान किया गया प्रोटोकॉल फाइब्रोब्लास्ट की भूमिका की निगरानी के लिए काफी अधिक तेजी से दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करेगा क्योंकि ट्यूमर के विकास की निगरानी कुछ हफ्तों में की जाएगी। प्रदान किया गया दृष्टिकोण भी काफी कम खर्चीला है क्योंकि इसे आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों की कॉलोनियों को उत्पन्न करने और आवास की आवश्यकता नहीं है। प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग माउस कॉलोनियों को विकसित करने की आवश्यकता के बजाय एसएचआरएनए का उपयोग करके विभिन्न जीनों के वध के प्रभाव का तेजी से परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। प्रदान किया गया दृष्टिकोण भी अधिक लचीला है क्योंकि यह फाइब्रोब्लास्ट की विभिन्न संख्याओं, कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स के विभिन्न अनुपातों, विभिन्न जीनों के वध और यहां तक कि विभिन्न ऊतक साइटों या प्रजातियों से फाइब्रोब्लास्ट की तुलना की अनुमति देगा। क्रे-लॉक्स दृष्टिकोण का लाभ यह होगा कि फाइब्रोब्लास्ट अधिक शारीरिक संदर्भ में चूहों के भीतर मौजूद हैं।
यहां बताया गया प्रोटोकॉल उन वैज्ञानिकों के लिए मूल्यवान होगा जो ट्यूमर के विकास पर फाइब्रोब्लास्ट के प्रभावों की निगरानी करना चाहते हैं और प्रभावी ढंग से लागत करते हैं। यह प्रोटोकॉल ट्यूमर के विकास पर ट्यूमर के विकास पर विभिन्न स्रोतों से फाइब्रोब्लास्ट या फाइब्रोब्लास्ट के विभिन्न उपसमुच्चय की जांच करने वाले वैज्ञानिकों के लिए विशेष रूप से मूल्यवान है। यदि यह महत्वपूर्ण है कि ट्यूमर दीक्षा एक शारीरिक संदर्भ में होती है, तो आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल पर विचार किया जाना चाहिए।
इन प्रयोगों को करने के लिए कई संभावित दृष्टिकोण हैं। प्रतिरक्षा-सक्षम चूहों को मेजबान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो फाइब्रोब्लास्ट-प्रतिरक्षा कोशिका इंटरैक्शन की जांच की अनुमति देगा। प्रतिरक्षा-सक्षम माउस मॉडल के लिए, माउस कैंसर कोशिकाओं और माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) को इंजेक्ट किया जाना चाहिए। एमईएफ का उपयोग अन्वेषक को रुचि के जीन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का परीक्षण करने के लिए नॉकआउट माउस उपभेदों की विस्तृत श्रृंखला का लाभ उठाने की अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, प्रतिरक्षा की कमी वाले चूहों का उपयोग चूहों में ट्यूमर के विकास को बढ़ावा देने में मानव फाइब्रोब्लास्ट की भूमिका का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है जो मानव कैंसर कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं। कैंसर कोशिकाओं का परिचय चमड़े के नीचे या ऑर्थोटोपिक रूप से किया जा सकता है। मेलेनोमा के लिए, जैसा कि नीचे वर्णित है, ट्यूमर-फाइब्रोब्लास्ट मिश्रण को ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के लिए इंट्राडर्मल रूप से इंजेक्ट किया जा सकता है जो त्वचा के भीतर उस स्थान को अधिक बारीकी से अनुकरण करता है जहां मेलेनोमा विकसित होगा।
चित्रा 1 में प्रयोग में, मानव ए 2058 मेलेनोमा कोशिकाओं के साथ मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट को सह-पेश करने के परिणामस्वरूप मेलेनोमा कोशिकाओं को सह-इंजेक्शन फाइब्रोब्लास्ट के बिना पेश किए जाने क?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक सहायक इनपुट के लिए कोलर प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को स्वीकार करना चाहते हैं। एच.ए.सी. रीता एलन फाउंडेशन के मिल्टन ई. कैसल विद्वान थे। हम एनआईएच /एनसीआई 1 आर01 सीए 221296-01 ए 1, एनआईएच 1 आर 01 एआर 070245-01 ए 1, मेलेनोमा रिसर्च एलायंस टीम साइंस अवार्ड, कैंसर रिसर्च इंस्टीट्यूट क्लिनिकल लेबोरेटरी इंटीग्रेशन प्रोग्राम अवार्ड, आईरिस कैंटर महिला स्वास्थ्य केंद्र / यूसीएलए सीटीएसआई एनआईएच ग्रांट यूएल 1टीआर 000124, कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय कैंसर अनुसंधान समन्वय समिति, डेविड गेफेन स्कूल ऑफ मेडिसिन मेटाबोलिज्म अवार्ड, क्लिनिकल ट्रांसलेशनल साइंस इंस्टीट्यूट और जॉन्सन कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर को स्वीकार करते हैं। ब्रॉड स्टेम सेल रिसर्च सेंटर (रोज हिल्स और हा गाबा) से नवाचार पुरस्कार, प्रोस्टेट कैंसर में यूसीएलए एसपीओआर (पुरस्कार संख्या पी 50सीए092131 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान) से एक पुरस्कार, ब्रॉड स्टेम सेल सेंटर, एली और एडिथ ब्रॉड सेंटर ऑफ रीजनरेटिव मेडिसिन एंड स्टेम सेल रिसर्च से एक नवाचार पुरस्कार, यूसीएलए में पुनर्योजी चिकित्सा और स्टेम सेल अनुसंधान के एली और एडिथ ब्रॉड सेंटर, ट्यूमर सेल बायोलॉजी ट्रेनिंग प्रोग्राम (यूएसएचएचएस रूथ एल किर्शस्टीन संस्थागत राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार # टी 32 सीए 009056), यूसीएलए एआर 071307 में त्वचाविज्ञान टी 32 कार्यक्रम, और यूसीएलए मांसपेशी कोशिका जीव विज्ञान, पैथोफिज़ियोलॉजी और चिकित्सीय टी 32 प्रशिक्षण कार्यक्रम 5 टी 32 एएफ 65972।
26G Needles | Fisher Scientific | 14-826-10 | |
Alcohol swabs | Fisher Scientific | 326895 | |
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 | WAHL Professional | 8787-450A | |
Athymic nude mice (NU/J) | The Jackson labs | 002019 | These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced. |
Cancer cells | ATCC | ATCC® CRL-11147™ | This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used. |
Cell Culture Multi Flasks | Fisher Scientific | 14-826-95 | |
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Countess Cell Counting Chamber | Fisher Scientific | C10228 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 11965-118 | |
Fetal bovine serum | Fisher Scientific | MT35010CV | |
Fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used. |
Isoflurane | Henry Schein Animal Health | NDC 11695-6776-2 | |
PBS USP grade for injection into mice | Fisher Scientific | 50-751-7476 | |
Sterile 10 ml serological pipet | Celltreat | 667210B | |
Sterile 5 ml serological pipet | Celltreat | 229005B | |
Sterile 50 ml centrifuge tubes | Genesee Scientific | 28-108 | |
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns | Fisher Scientific | 09-740-61A | |
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 15400054 | |
Sterile tissue-culture grade PBS | Fisher Scientific | 50-751-7476 | |
Sterle 25 ml serological pipet | Celltreat | 667225B | |
TC treated 100 x 20 mm dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
TC treated 150 x 20 mm dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
TC treated 60 x 15 mm dishes | Genesee Scientific | 25-260 | |
Trypan blue | Fisher Scientific | C10228 |