腫瘍増殖における癌関連線維芽細胞の役割を調べるためのマウスモデル
Summary
癌細胞と線維芽細胞を同時注入し、腫瘍の成長を経時的に監視するためのプロトコルが提供されます。このプロトコルは、腫瘍増殖の調節因子としての線維芽細胞の役割の分子基盤を理解するために使用できます。
Abstract
がん関連線維芽細胞(CAF)は、腫瘍を促進する微小環境を作り出すことにより、腫瘍の成長に重要な役割を果たすことができます。腫瘍微小環境におけるCAFの役割を研究するためのモデルは、線維芽細胞、さまざまな組織からの線維芽細胞、および線維芽細胞の特定の遺伝的要因の機能的重要性を理解するのに役立ちます。マウスモデルは、in vivoの状況における腫瘍の成長と進行の寄与を理解するために不可欠です。ここでは、がん細胞を線維芽細胞と混合し、マウスに導入して腫瘍を発生させるプロトコールを提供する。経時的な腫瘍サイズと最終的な腫瘍重量が決定され、グループ間で比較されます。記載されたプロトコルは、腫瘍の成長および進行におけるCAFの機能的役割についてより多くの洞察を提供することができる。
Introduction
腫瘍微小環境の中で、最も顕著な細胞型の1つは、がん関連線維芽細胞(CAF)1です。これらの癌腫関連線維芽細胞は、腫瘍抑制の役割を果たすことができる2,3。例えば、S100A発現線維芽細胞は、発がん物質をカプセル化し、癌腫形成から保護することができるコラーゲンを分泌する4。さらに、膵臓がんにおけるα平滑筋アクチン(SMA)陽性筋線維芽細胞の枯渇は免疫抑制を引き起こし、膵臓がんの進行を加速させます2。CAFはまた、癌細胞と共進化し、腫瘍の進行を促進することができます5、6、7、8。線維芽細胞は、腫瘍促進環境を作り出す細胞外マトリックスタンパク質を合成して分泌することができる8。これらの細胞外マトリックスタンパク質は、組織の機械的硬化を引き起こす可能性があり、これは腫瘍の進行に関連する9,10。沈着した細胞外マトリックスは、免疫浸潤11を阻害する物理的障壁として作用することができる。CAFsによるマトリックス沈着は、CAFsによって生成されるフィブロネクチンが腫瘍浸潤を促進することが示されているため、腫瘍浸潤とも関連している12。CAFは、トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)、血管内皮増殖因子(VEGF)、インターロイキン-6(IL-6)、およびCXC-ケモカインリガンド12(CXCL12)を分泌することにより、血管新生を促進し、免疫抑制細胞を腫瘍微小環境に動員します13,14,15。腫瘍増殖の促進における中心的な役割のために、癌関連線維芽細胞は抗癌療法の新たな標的である6,16,17,18。
以下のプロトコルは、十分に確立され広く使用されている腫瘍増殖のマウスモデルにおいて、線維芽細胞が腫瘍の成長にどのように影響するかをテストするための方法について説明しています。腫瘍微小環境における線維芽細胞の重要性を理解するために、マウスに癌細胞を導入してその成長を監視するための標準プロトコルは、癌細胞導入を伴う線維芽細胞を含むように変更されました。癌細胞は、皮下または皮内に導入することができる。皮内導入は、皮膚自体から発生する腫瘍をもたらすであろう。癌細胞と線維芽細胞をマウスに同時注射する異種移植片は、癌増殖を促進する能力における線維芽細胞、線維芽細胞の亜集団、およびタンパク質因子の役割を分析するための重要な方法論的ツールを表しています19,20,21。癌細胞と線維芽細胞をマウスに同時注射するための詳細なプロトコルが提供されています。この方法は、線維芽細胞の存在または非存在を比較するために、異なる供給源からの線維芽細胞を比較するために20、または特定のタンパク質の発現の有無にかかわらず線維芽細胞を比較するために使用することができる19。癌細胞および線維芽細胞が導入された後、腫瘍の大きさを経時的にモニターすることができる。実験の終わりに、腫瘍を解剖して計量することができます。腫瘍の成長を経時的に監視することにより、さまざまな要因の重要性を分析できます。
腫瘍増殖における線維芽細胞の役割を研究するための可能な代替アプローチがあります。一例として、線維芽細胞で優先的に発現されるドライバーを有する遺伝子の組織特異的ノックアウトを提供するCre-loxedベースのモデルがある。このようなアプローチは、腫瘍の進行に対する線維芽細胞における特定の遺伝子および経路の役割を調査する機会も提供する。Cre-loxベースのアプローチと比較して、提供されたプロトコルは、腫瘍の成長がわずか数週間で監視されるため、線維芽細胞の役割を監視するためのはるかに迅速なアプローチを表します。提供されたアプローチはまた、遺伝子操作されたマウスのコロニーを生成および収容する必要がないため、大幅に安価である。提供されたプロトコルは、マウスコロニーを開発する必要なしに、shRNAを使用して異なる遺伝子のノックダウンの効果を迅速にテストするために使用できます。提供されたアプローチは、異なる数の線維芽細胞の比較、異なる癌細胞と線維芽細胞の比率、異なる遺伝子のノックダウン、さらには異なる組織部位または種からの線維芽細胞の比較を可能にするため、より柔軟である。Cre-loxアプローチは、線維芽細胞がより生理学的な状況でマウス内に存在するという利点を有するであろう。
ここで報告されたプロトコルは、腫瘍の成長に対する線維芽細胞の影響を迅速かつ費用効果の高い方法で監視しようとする科学者にとって価値があります。このプロトコルは、腫瘍増殖に対する腫瘍増殖に関する線維芽細胞または異なるソースからの線維芽細胞の異なるサブセットを調査する科学者にとって特に価値があります。腫瘍の開始が生理学的な状況で起こることが重要であるならば、遺伝子操作されたマウスモデルが考慮されるべきです。
これらの実験を実行するには、いくつかの可能なアプローチがあります。免疫コンピテントマウスを宿主として使用することができ、線維芽細胞と免疫細胞の相互作用の調査が可能になります。免疫コンピテントマウスモデルの場合、マウスがん細胞とマウス胚性線維芽細胞(MEF)を注射する必要があります。MEFを使用することで、研究者は広範囲のノックアウトマウス系統を利用して、目的の遺伝子の有無を試験することもできます。あるいは、免疫不全マウスを使用して、ヒト癌細胞に由来するマウスにおける腫瘍の増殖の促進におけるヒト線維芽細胞の役割を試験することができる。癌細胞の導入は、皮下または同所的に行うことができる。黒色腫の場合、後述するように、腫瘍-線維芽細胞混合物を皮内注射して、黒色腫が発症する皮膚内の位置をより厳密にシミュレートする同所性注射を行うことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
図1の実験では、ヒト皮膚線維芽細胞をヒトA2058メラノーマ細胞と同時導入すると、線維芽細胞を同時注入せずにメラノーマ細胞を導入した場合よりも大きな腫瘍が生じました。この差は、腫瘍の体積と腫瘍の重量に基づいて簡単に検出できます。結果は、癌関連線維芽細胞が腫瘍増殖を促進できるという複数の報告と一致しています5、6</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、有益な意見を提供してくれたColler研究室のすべてのメンバーに感謝したいと思います。H.A.C.は、リタ・アレン財団のミルトン・E・カッセル奨学生でした。NIH / NCI 1 R01 CA221296-01A1、NIH 1 R01 AR070245-01A1、黒色腫研究アライアンスチーム科学賞、がん研究所臨床検査統合プログラム賞、アイリスカンターウィメンズヘルスセンター/ UCLA CTSI NIHグラントUL1TR000124、カリフォルニア大学がん研究調整委員会、デビッドゲフィン医学部代謝テーマ賞、臨床トランスレーショナルサイエンスインスティテュート、ジョンソン総合がんセンター、 Broad Stem Cell Research Center(Rose Hills and Ha Gaba)からのInnovation Award、UCLA SPORE in Prostate Cancer(National Cancer Institute of the National Cancer Institute of the National Institutes of the National Institutes、Award Number P50CA092131)、Broad Stem Cell Center、Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research at UCLAからのイノベーション賞、 腫瘍細胞生物学トレーニングプログラム(USHHSルースL.キルシュスタイン機関国立研究サービス賞#T32 CA009056)、UCLA AR32の皮膚科T071307プログラム、およびUCLA筋細胞生物学、病態生理学および治療T32トレーニングプログラム5 T32 AF 65972。
Materials
| 26G Needles | Fisher Scientific | 14-826-10 | |
| Alcohol swabs | Fisher Scientific | 326895 | |
| Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 | WAHL Professional | 8787-450A | |
| Athymic nude mice (NU/J) | The Jackson labs | 002019 | These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced. |
| Cancer cells | ATCC | ATCC® CRL-11147™ | This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used. |
| Cell Culture Multi Flasks | Fisher Scientific | 14-826-95 | |
| Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Countess Cell Counting Chamber | Fisher Scientific | C10228 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | MT35010CV | |
| Fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used. |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | NDC 11695-6776-2 | |
| PBS USP grade for injection into mice | Fisher Scientific | 50-751-7476 | |
| Sterile 10 ml serological pipet | Celltreat | 667210B | |
| Sterile 5 ml serological pipet | Celltreat | 229005B | |
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Genesee Scientific | 28-108 | |
| Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns | Fisher Scientific | 09-740-61A | |
| Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 15400054 | |
| Sterile tissue-culture grade PBS | Fisher Scientific | 50-751-7476 | |
| Sterle 25 ml serological pipet | Celltreat | 667225B | |
| TC treated 100 x 20 mm dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| TC treated 150 x 20 mm dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| TC treated 60 x 15 mm dishes | Genesee Scientific | 25-260 | |
| Trypan blue | Fisher Scientific | C10228 |
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