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Developmental Biology

फिनोलॉजिकल मॉनिटरिंग, हैंड परागण, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और मॉलिक्यूलर जेनोटीपिंग द्वारा जापानी बेर में परागण आवश्यकताओं की स्थापना

Published: November 9, 2020 doi: 10.3791/61897
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2
1Unidad de Hortofruticultura, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza), Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX), Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

Summary

जापानी बेर-प्रकार के संकरों में परागण आवश्यकताओं के निर्धारण के लिए एक पद्धति का वर्णन किया गया है, जो पीसीआर द्वारा एस-जीनोटाइप की पहचान और परागकाइजर के चयन के लिए फूलों की निगरानी के साथ फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत क्षेत्र और प्रयोगशाला-परागण और पराग ट्यूबों की टिप्पणियों को जोड़ती है।

Abstract

जापानी बेर की खेती आमतौर पर उगाई जाने वाली अन्य प्रूनस सैलिसिना के साथ मूल प्रूनस सैलिसिना के बीच क्रॉस से प्राप्त इंटरप्रीस हाइब्रिड हैं। अधिकांश संकर गेमटोफाइटिक आत्म-असंगति प्रदर्शित करते हैं, जो एकल और अत्यधिक बहुरूपी एस-लोकस द्वारा नियंत्रित होता है जिसमें कई एलील्स होते हैं। अधिकांश खेती किए गए संकर स्वयं असंगत हैं और अपने फूलों को उपजाऊ बनाने के लिए एक संगत दाता से पराग की आवश्यकता होती है। जापानी बेर में परागण आवश्यकताओं की स्थापना तेजी से अज्ञात परागण आवश्यकताओं के साथ नई खेती की उच्च संख्या के कारण महत्वपूर्ण होता जा रहा है । इस काम में, जापानी बेर-प्रकार के संकर में परागण आवश्यकताओं के निर्धारण के लिए एक पद्धति का वर्णन किया गया है। स्व-(में) अनुकूलता दोनों क्षेत्र और प्रयोगशाला में हाथ से परागण द्वारा निर्धारित की जाती है, जिसके बाद फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ पराग ट्यूब विस्तार की निगरानी की जाती है, और क्षेत्र में फल परिपक्वता की निगरानी भी की जाती है। परागणक खेती के चयन का आकलन क्षेत्र में फूलों के समय की निगरानी के साथ पीसीआर विश्लेषण द्वारा एस-जीनोटाइप की पहचान को मिलाकर किया जाता है । खेती की परागण आवश्यकताओं को जानने से नए बगीचों के डिजाइन के लिए खेती के चयन की सुविधा होती है और स्थापित बगीचों में परागण की कमी से संबंधित उत्पादकता समस्याओं का शीघ्र पता लगाने की अनुमति देता है ।

Introduction

जापानी बेर(प्रूनस सालिकिना लिंडल.) चीन1के मूल निवासी है । 19वीं शताब्दी में, इस फसल को जापान से संयुक्त राज्य अमेरिका में पेश किया गया था, जहां इसे अन्य उत्तरी अमेरिकी डिप्लॉयड प्लम2के साथ इंटरक्रॉस किया गया था। 20 वीं शताब्दी में,इनमें से कुछ संकर दुनिया भर के शीतोष्ण क्षेत्रों में फैले हुए थे। आजकल, "जापानी बेर" शब्द मूल पी सेलिकिना के बीच पार से प्राप्त अंतरप्रजातिक संकरों की एक विस्तृत श्रृंखला को संदर्भित करता है, जिसमें 15 अन्य डिप्लॉयड प्रूनस एसपीपी3,4, 5हैं।

रोसासी परिवार की अन्य प्रजातियों की तरह जापानी बेर, गेमोफाइटिक सेल्फ-इनकंकेटिबिलिटी (जीएसआई) को प्रदर्शित करता है, जिसे एकल और अत्यधिक बहुरूपी एस-टिड्डीद्वारा नियंत्रित किया जाता है जिसमें कई एलील्स6होते हैं। एस-लोकसमें दो जीन होते हैं जो पिस्टिल में व्यक्त किए गए एक रिबोन्यूलीज(एस-आरएनएएस)को एन्कोड करते हैं, और पराग कण7में व्यक्त एक एफ-बॉक्स प्रोटीन (एसएफबी)। आत्म-असंगति प्रतिक्रिया में, जब पराग कण (हैप्लॉयड) में व्यक्त एस-एलील पिस्टिल (डिप्लॉयड) में व्यक्त किए गए दो में से एक के समान है, तो शैली में पराग ट्यूब की वृद्धि को एस-आरएनएसई8 की कार्रवाई द्वारा पराग ट्यूब आरएनए के क्षरण के कारण गिरफ्तार कियाजाताहै। चूंकि यह प्रक्रिया ओव्यूल में मादा गेमोफाइट के निषेचन को रोकती है, इसलिए जीएसआई खेती के बीच आउटक्रॉसिंग को बढ़ावा देता है।

हालांकि कुछ जापानी बेर खेती आत्म संगत कर रहे हैं, सबसे खेती वर्तमान में उगाया आत्म असंगत हैं, और अंतर संगत दाताओं से पराग की जरूरत है उनके फूल3निषेचित । पत्थर के फलों मेंबादाम9,खुबानी10, 12और मीठी चेरी13जैसे जीनस प्रूनस की प्रजातियों में, विभिन्न दृष्टिकोणों द्वारा खेती की परागण आवश्यकताओं को स्थापित किया जा सकता है। स्व-(में) अनुकूलता क्षेत्र में फूलों के आत्म-परागण और फल सेट की बाद की निगरानी, या प्रयोगशालामें नियंत्रित स्थितियों पर अर्ध-इन वीवो आत्म-परागण और माइक्रोस्कोप14, 15, 16,17, 18के तहत पराग ट्यूबों के अवलोकन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है . खेती के बीच असंगति संबंधों को क्षेत्र में क्रॉस परागण या प्रयोगशाला द्वारा संभावित परागणक खेती के पराग का उपयोग करके और पीसीआरविश्लेषण14, 15, 16, 19,20,21, 22द्वारा प्रत्येक खेती के एस-एलील्सकी पहचान द्वारा निर्धारित किया जा सकताहै। . मीठी चेरी या बादाम जैसी प्रजातियों में, आत्म-अनुकूलता का आकलन स्वयं-अनुकूलता से जुड़े विशेष एस एलील्स की पहचान द्वारा भी किया जा सकता है,जैसे एस4' मीठी चेरी13 में या बादाम23में एसएफ ।

मुख्य उत्पादक देशों के कई बेर प्रजनन कार्यक्रम अज्ञात परागण आवश्यकताओं के साथ कई नई खेती2,14,उनमें से कई जारी कर रहे हैं। इस काम में, जापानी बेर-प्रकार के संकर में परागण आवश्यकताओं के निर्धारण के लिए एक पद्धति का वर्णन किया गया है। स्व-(में) अनुकूलता क्षेत्र और प्रयोगशाला दोनों में आत्म-परागण द्वारा निर्धारित की जाती है, जिसके बाद फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत पराग ट्यूबों की टिप्पणियों का पालन किया जाता है। परागणक खेती का चयन क्षेत्र में फूल समय की निगरानी के साथ पीसीआर विश्लेषण द्वारा एसजीनोटाइप की पहचान को जोड़ती है।

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Protocol

1. क्षेत्र में हाथ परागण

  1. पराग निष्कर्षण
    1. पराग प्राप्त करने के लिए , स्टेज डी24पर फूलों की कलियों को इकट्ठा करें , जो चरण 57 के अनुसार बीबीसीएच स्केल25,26पर है ।
      नोट: अन्य प्रुनस प्रजातियों की तुलना में जापानी बेर में अधिक फूलों की कलियों आवश्यक हैं क्योंकि उनके एंथर्स कम पराग का उत्पादन करते हैं।
    2. प्लास्टिक की जाली (2 मिमी x 2 मिमी पोर आकार) का उपयोग करके एंथर्स को हटा दें और उन्हें 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर कागज पर रखें जब तक कि एंथर डिहिसेंस न हो जाए।
    3. एक ठीक जाल (0.26 मिमी x 0.26 मिमी ताकना आकार) के माध्यम से पराग कणों को छलनी करें, और उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक टोपी के साथ 10 एमएल ग्लास ट्यूब में उन्हें संरक्षित करें।
  2. नपुंसक फूलों का परागण
    1. जब 10%-20% फूलों के बीच खुले हैं, तो कई शाखाओं का चयन और लेबल करें। बीबीसीएचस्केल25, 26पर स्टेज 57 के अनुसार, स्टेज डी 24 पर केवल फूलों की कलियों कोछोड़कर खुलेफूलों और युवा कलियों को हटा दें।
    2. नाखूनों या चिमटी के साथ प्रति उपचार प्रति 800 और 1,000 फूल कलियों के बीच की पंखुड़ियों, सेपल्स और पुंकेसर को हटा दें।
    3. हाथ से पिस्टिन्स को नपुंसकता के बाद बारीक तूलिका 24 घंटे की मदद से परागण करें। कुछ शाखाएं जिनमें आधी पिस्टिल एक ही खेती के पराग के साथ होती हैं, और दूसरी आधी अन्य खेती से संगत पराग के साथ नियंत्रण के रूप में। अन्य खेती से पराग कणों के साथ उंगलियों या तूलिका को दूषित न करें, सावधान रहें।
    4. फूलों की साप्ताहिक गिनती रिकॉर्ड और फल ड्रॉप पैटर्न की विशेषता के लिए फल विकसित करने और प्रत्येक परागण उपचार में सेट अंतिम फल की मात्रा ।
  3. क्षेत्र में अनुपूरक परागण
    1. पहले फूलों के खुलने से कुछ दिन पहले, परागण कीड़ों के आगमन से बचने के लिए 0.8 मिमी जाल पिंजरे में चयनित पेड़ों को संलग्न करें।
    2. जब 10%-20% फूल खुले होते हैं, तो परागण उपचार के अनुसार कई शाखाओं का चयन और लेबल करें, जिससे प्रति उपचार 1,000-1500 फूल छोड़ ें।
    3. अगले दिन, जब फूल खुले होते हैं, तो प्रत्येक फूल को इसी पराग के साथ तूलिका की मदद से परागण करें (स्वयं परागण के लिए एक ही खेती से पराग, और अन्य संगत खेती से क्रॉस-परागण नियंत्रण के रूप में)।
    4. हर दूसरे दिन परागण जब तक सभी फूल खुले।
    5. फूलों की साप्ताहिक गिनती रिकॉर्ड करें और फल ड्रॉप पैटर्न की विशेषता के लिए संज्ञा देने के लिए संज्ञाहरण से फलों का विकास करें और प्रत्येक परागण उपचार में निर्धारित अंतिम फलों की मात्रा निर्धारित करें।

2. प्रयोगशाला में हाथ परागण

  1. स्टेज डी24में 50-100 फूल ले लीजिए , बीबीसीएच स्केल 25,26पर स्टेज57के अनुसार ।
  2. प्रयोगशाला में, प्रति उपचार (आत्म-और क्रॉस-परागण) 30 फूलों को कम करें।
    नोट: पिस्टिल्स पर किसी भी नुकसान से बचने के लिए ईमास्कुलेशन को सावधानी से आगे बढ़ाया जाना चाहिए।
  3. गीले फूलों के फोम (प्रत्येक परागण उपचार के लिए फोम का एक टुकड़ा) के एक टुकड़े पर रखने से पहले प्रत्येक फूल पेडीकेल पानी के नीचे के आधार पर एक ताजा कटौती करें।
  4. हाथ प्रत्येक पिस्टिल 24 घंटे बाद पराग के साथ एक ठीक तूलिका का उपयोग कर पहले पराग पराग (धारा 1.1 देखें) परागण । एक ही खेती से पराग के साथ पिस्टिल के एक सेट को परागित करें, और दूसरा नियंत्रण के रूप में एक संगत खेती से पराग के साथ सेट करें।
  5. कमरे के तापमान पर परागण के बाद परागण पिस्टिल 72 घंटे छोड़ दें। फूलों का झाग लगातार पानी से गीला होना चाहिए।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 24 घंटे के लिए इथेनॉल/एसिटिक एसिड (3:1) के एक फिक्सिव सॉल्यूशन में पिस्टिल्स को ठीक करें। फिक्सेटिव को 75% इथेनॉल से बदलें। इस घोल में27का उपयोग होने तक नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित किया जा सकता है ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि नमूने पूरी तरह से समाधान में डूबे हुए हैं।

3. सूक्ष्म अवलोकन

  1. इन विट्रो पराग अंकुरण का मूल्यांकन
    1. पराग अंकुरण माध्यम को विस्तृत करने के लिए, 250 एमएल आसुत पानी पर 25 ग्राम सुक्रोज को भंग करें, फिर 0.075 ग्राम कैल्शियम नाइट्रेट [सीए (नंबर3)2]और 0.075 ग्राम बोरिक एसिड (एच 3 बी3)जोड़ें।
    2. समाधान में 2 ग्राम आगर जोड़ें और28को पूरी तरह से भंग होने तक मिलाएं।
    3. मीडियम को स्टरलाइज करने के लिए इसे 20 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेव करें। मध्यम शांत और, इससे पहले कि यह जमना, एक बाँझ लैमिनार प्रवाह हुड में 3 एमएल प्रति बाँझ पेट्री डिश (55 मिमी x 12 मिमी) वितरित करें। मध्यम ठोसकरण के बाद, उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे पेट्री व्यंजनों का संरक्षण करें।
    4. पहले दो पेट्री व्यंजनों में नियंत्रित परागण में पराग दाता के रूप में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक खेती के पराग को फैलाएं और उन्हें 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: टीका लगाया संस्कृति मीडिया तुरंत बाद माइक्रोस्कोपी के साथ देखा जा सकता है या उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। इस उद्देश्य के लिए, पेट्री व्यंजन माइक्रोस्कोपी टिप्पणियों से पहले फ्रीजर से फ्रिज 24 घंटे में बदल दिया जाना चाहिए।
    5. पराग कणों का निरीक्षण करने के लिए, 1% (v/v) एनिलाइन ब्लू समाधान तैयार करें जो कैलिस को दाग देता है। सबसे पहले, आसुत पानी के 1,000 मिलीएल में 7.97 ग्राम के 3पीओ4को भंग करके 0.1 एन पोटेशियम फॉस्फेट ट्राइबेसिक (के3पीओ4) समाधान तैयार करें। 1% (v/v) एनिलाइन ब्लू सॉल्यूशन को विस्तृत करने के लिए, 0.1 एन के3पीओ4के 100 एमएल में एनलीन ब्लू के 1 एमएल को भंग करें।
    6. प्रत्येक पेट्री डिश प्लेट में एनीलिन ब्लू सॉल्यूशन की 2-3 बूंदें जोड़ें और एक्सिटर फिल्टर बीपी340-390 और बैरियर फिल्टर एलपी 425 का उपयोग करके यूवी एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत 5 मिनट के बाद निरीक्षण करें। प्रति प्लेट तीन क्षेत्रों में व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य परागकणों की गणना करें, प्रत्येक खेती के लिए दो पेट्री व्यंजनों में 100-200 परागकणों वाले प्रत्येक क्षेत्र।
  2. पराग ट्यूब विकास
    1. डिस्टिल्ड पानी के साथ फिक्स्ड पिस्टिलों को तीन बार (1 घंटे प्रत्येक, कुल में 3 एच) और 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5% (w/v) सोडियम सल्फेट(एनए 2एसओ3)में स्थानांतरित करें । इस घोल को तैयार करने के लिए 100 एमएल डिस्टिल्ड वाटर में 5 ग्राम सोडियम सल्फेट घोल लें।
    2. ऊतकों को नरम करने के लिए 5% (w/v) सोडियम सल्फेट में 8 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर पिस्टिलों को ऑटोक्लेव करें।
    3. स्क्वैश एक स्लाइड पर एक कवर ग्लास के नीचे 1% (v/v) aniline नीले समाधान की एक बूंद में पिस्टिल्स नरम करने के लिए दाग callose ।
    4. एक्ससिएटर फिल्टर BP340-390 और बैरियर फिल्टर LP425 का उपयोग करके यूवी एपिफ्लोरेसेंस के साथ एक माइक्रोस्कोप के तहत शैली के साथ पराग ट्यूब विकास का निरीक्षण करें।

4. असंगति संबंधों का निर्धारण

  1. पत्तियों से डीएनए निष्कर्षण
    1. डीएनए निकालने के लिए, क्षेत्र में प्रत्येक खेती के 3-4 युवा पत्तियों को इकट्ठा करें, अधिमानतः वसंत ऋतु में।
      नोट: डीएनए भी परिपक्व पत्तियों से निकाला जा सकता है, लेकिन युवा पत्तियों से डीएनए कम फेनोलिक यौगिकों है ।
    2. एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर डीएनए को अलग करें और प्रदान की गई प्रोटोकॉल किट का पालन करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    3. डीएनए एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें और यूवी-विस माइक्रोवोल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में 260 एनएम पर प्रत्येक नमूने के डीएनए की गुणवत्ता का मूल्यांकन करें। डीएनए एकाग्रता को 10 एनजी/μL में समायोजित करें ।
  2. टुकड़ा प्रवर्धन के लिए पीसीआर की स्थिति
    1. लेबल 0.2 मिलील पीसीआर ट्यूब और टोपियां।
    2. टेबल 1 के अनुसार पीसीआर रिएजेंट तैयार करें और उन्हें बर्फ पर गल जाने दें।
    3. प्रतिक्रियाओं की संख्या के अनुसार 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में प्राइमर की प्रत्येक जोड़ी के मास्टर मिश्रण की मात्रा स्थापित करें, प्रतिक्रिया प्रति 16 माइक्रोन की मात्रा को ध्यान में रखते हुए प्रतिक्रियाओं की संख्या के साथ-साथ अतिरिक्त। टेबल 1 में ऑर्डर का पालन करने वाले रिएजेंट्स जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
    4. प्रत्येक 0.2 मिलीएल पीसीआर ट्यूब में मास्टर मिश्रण के 16 माइक्रोन जिसमें डीएनए टेम्पलेट के 4 माइक्रोन या नकारात्मक नियंत्रण (सी-) के रूप में स्टरलाइज्ड आसुत पानी का 4 माइक्रोन होता है। ज्ञात जीनोटाइप के साथ खेती के डीएनए का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में करें। धीरे-धीरे मिलाएं, कैप्स के साथ रिएक्शन ट्यूब बंद करें, और रिएक्शन ट्यूब के नीचे पूरी मात्रा इकट्ठा करने के लिए 30 एस के लिए 2,000 x g पर सेंट्रलिफुटेट करें।
    5. थर्मोसाइकिलर में प्रतिक्रिया ट्यूब रखें और निम्नलिखित तापमान प्रोफ़ाइल का उपयोग करके पीसीआर कार्यक्रम स्थापित करें: 94 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट का प्रारंभिक चरण, 94 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट का 35 चक्र, 56 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट और 72 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट का अंतिम चरण 72 डिग्री सेल्सियस20।
  3. इलेक्ट्रोफोरेसिस और टुकड़े के आकार का अनुमान
    1. 1.7% (w/v) एग्राजॉर्ड मिनी जेल तैयार करने के लिए, 0.68 ग्राम एगर उठी और 1x टीएबी बफर के 40 एमएल को 100 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में भंग करें। उबलने से बचने के लिए 30 एस अंतराल पर 600 डब्ल्यू पर माइक्रोवेव में गर्म करके समाधान पिघलाएं।
    2. समाधान को ठंडा करने के लिए बेंच पर रहने दें, और फिर न्यूक्लिक एसिड धुंधला समाधान के 3.5 माइक्रोन जोड़ें।
    3. जेल ट्रे को कास्टिंग स्टैंड में रखें और चयनित कंघी को जेल मोल्ड में डाल दें। प्रत्येक पीसीआर उत्पाद और डीएनए सीढ़ी के लिए पर्याप्त कुओं के लिए सुनिश्चित करें।
    4. एगर उठे समाधान को जेल मोल्ड में डालें और इसे बहुलीकरण तक ठंडा होने दें। पॉलीमराइज्ड जेल की कंघी निकालें। जेल की सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त 1x TBE बफर युक्त क्षैतिज इलेक्ट्रोफोरेसिस सिस्टम में जेल रखें।
    5. डीएनए आणविक वजन सीढ़ी (1 केबी डीएनए सीढ़ी) के 2 μL के साथ पहले और अंतिम कुओं लोड। दूसरे कुओं में पीसीआर के प्रत्येक उत्पाद का 3 माइक्रोन लोड करें। कक्ष को बंद करें, बिजली चालू करें, और 30 मिनट के लिए 100 वी पर जेल चलाएं।
    6. जेल दस्तावेज प्रणाली का उपयोग करके यूवी प्रकाश के तहत जेल का निरीक्षण करें। प्रवर्धित टुकड़े के आकार को निर्धारित करने के लिए डीएनए आणविक वजन सीढ़ी का उपयोग करें और इसी एलील्स की पहचान करने के लिए सकारात्मक नियंत्रणों के साथ इसकी तुलना करें।

5. फूल तिथियों की निगरानी

  1. विभिन्न वर्षों में फूल पर प्रत्येक खेती के विभिन्न पेड़ों की फेनोलॉजी की निगरानी करें। फूलों की अवधि की लंबाई पहले (लगभग 5%) से अंतिम खुले फूलों (लगभग 95%) तक स्थापित करें। बीबीसीएच स्केल25 , 26पर स्टेज 65 के अनुसार, कम से कम 50% फूल स्टेज एफ24पर होने पर पूर्ण खिलने पर विचारकियाजाताहै ।
  2. अंतर-संगत खेती की फूल तिथियों की तुलना करने और उन लोगों को निर्धारित करने के लिए जो हर साल फूल के समय में मेल खाते हैं, कई वर्षों से डेटा के साथ फूल के समय का कैलेंडर विस्तृत करें।

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Representative Results

प्रत्येक जापानी बेर फूल कली में 1-3 फूलों के साथ एक पुष्पकता होती है। अन्य पत्थर के फलों की प्रजातियों की तरह, प्रत्येक फूल चार वेश्याओं से बना होता है: कार्पेल, पुंकेसर, पंखुड़ियां और सेपल्स, जो फूल के आधार पर एक कप बनाने वाले जुड़े हुए हैं। फूल संरचनाएं अन्य पत्थर के फलों की तुलना में छोटी होती हैं, जिसमें एक छोटी और नाजुक पिस्टिल होती है जो पुंकेसर से घिरा होता है जिसमें परागकणों की थोड़ी मात्रा होती है। पूर्ण खिलने पर, प्रत्येक पुष्पप्रान के फूल छोटे डंठल पर अलग दिखाई देते हैं, जिसमें सफेद पंखुड़ियों को दिखाती है जो एनथेसिस से पहले के दिनों में हरे रंग के सेपल्स (स्टेज डी, 57 बीबीसीएच)(चित्रा 1A)से घिरे गुब्बारे का गठन करती हैं। फूल संज्ञाहरण में पूरी तरह से खुला है, एंथर्स और पिस्टिल (चरण एफ, 65 BBCH)(चित्रा 2A)दिखा रहा है। अन्य शीतोष्ण प्रूनस एसपीपी की तरह, फूल की कलियां पहले खुलती हैं, और पत्ती की कलियां कई दिनों बाद अंकुरित होती हैं। यह खिलने वाले पेड़ों को शानदार लगता है जो बड़ी संख्या में फूल दिखाते हैं लेकिन कोई पत्तियां नहीं।

जापानी बेर में हाथ परागण एंथेसिस(चित्रा 1A)के पिछले गुब्बारे के चरण में फूलों के संग्रह की आवश्यकता होती है, जिसमें पिस्टिल और पुंकेसर लगभग परिपक्व होते हैं, लेकिन एंथर्स अभी भी अनिर्धारित हैं। यह चरण बाहरी पराग ले जाने वाले कीड़ों के आगमन को रोकता है क्योंकि पंखुड़ियां अभी भी बंद हैं। हालांकि अन्य प्रूनस प्रजातियों की तुलना में फूलों की संख्या बहुत अधिक है, उनमें से अधिकांश (85%-95%) फल सेट करने में सक्षम नहीं हैं। नतीजतन, परागण प्रयोगों के लिए फूलों की एक उच्च संख्या का उपयोग करना अनिवार्य है। अनिर्धारित एंथर्स को प्रयोगशाला में फूल से आसानी से अलग किया जा सकता है और कागज के एकटुकड़े (चित्रा 1 बी)पर बढ़ाया जा सकता है, जहां एंथर्स को कमरे के तापमान पर 24 घंटे के बाद dehisced किया जाता है, पराग अनाज(चित्रा 1C)दिखाता है। फिर, पराग कणों को आसानी से एक ठीक जाल(चित्रा 1D)के माध्यम से प्राप्त किया गया था, और तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या उपयोग तक संग्रहीत, दोनों क्षेत्र के लिए(चित्रा 2A-D)और/या प्रयोगशाला परागण(चित्रा 2ई, एफ)।

नपुंसकता(चित्रा 2ए, बी)या गैर-नपुंसक फूलों के अनुपूरक परागण(चित्रा2सी, डी)के बाद हाथ से परागण फूलों की फल बूंद की निगरानी से उपचार के बीच स्पष्ट अंतर दिखाई दिया । अधिकांश फूल दोनों उपचारों में परागण के 2-3 सप्ताह बाद गिरा। सभी आत्म परागण फूल गिरा दिया । हालांकि, अनुपूरक परागण उपचार से स्वयं परागण फूलों का 4% फसल तक पेड़ में बना रहा, यह दर्शाता है कि यह खेती (रूबिरोसा) आत्म-संगत(चित्रा 3)के रूप में व्यवहार करती है। नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने वाले क्रॉस-परागणित फूलों का व्यवहार भी उपचारों के बीच भिन्न होता है। अनुपूरक परागण के साथ क्रॉस-परागण फूल परागण के 3 सप्ताह बाद तक गिर गए, जिसके परिणामस्वरूप फल सेट का 7% होता है। हालांकि, सभी नपुंसक क्रॉस-परागण फूल सभी आत्म-परागण फूलों की बूंद के साथ मेल खाते हैं।

प्रयोगशाला में हाथ परागण के लिए, पिस्टिलों को गीले फूलों के फोम में प्रत्येक फूल पेडीकेल पानी केनीचे (चित्रा 2E)के आधार पर एक ताजा कटौती के बाद रखा गया था और बाद में एक ठीक ब्रश(चित्रा 2F)की मदद से 24 घंटे परागण किया गया था। स्व-परागणित फूलों में, आत्म-संगत खेती ने कम से कम एक पराग ट्यूब को अधिकांश पिस्टिलों में शैली के आधार तक पहुंचने के लिए दिखाया, जबकि स्वयं-असंगत खेती में, पराग ट्यूब विकास को ऊपरी शैली(तालिका 2)में गिरफ्तार किया गया था।

इन विट्रो पराग अंकुरण खेती(तालिका 3)के बीच काफी भिन्न था। अच्छा पराग व्यवहार्यता माना जाता था जब पराग कणों के 20% से अधिक संस्कृति माध्यम(चित्रा 4A)में 24 घंटे के बाद अपनी लंबाई से अधिक समय तक एक पराग ट्यूब दिखाया । हालांकि, जब अधिकांश पराग कण(चित्र 4बी)अंकुरित नहीं हुए, तो खेती को पुरुष बाँझ माना जाता था और परागणक के रूप में उपयुक्त नहीं था।

अन्य प्रूनसकी तरह, पिस्टिल तीन संरचनाओं से बना है: कलंक, शैली और अंडाशय। अंडाशय में दो अंडाशय होते हैं, और उनमें से कम से कम एक को फलने के लिए निषेचित किया जाना चाहिए। परागण के दौरान, पराग कणों को कलंक में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जहां अंकुरण 24 घंटे(चित्र 4सी) केभीतर हुआ था। प्रत्येक अंकुरित पराग कण ने एक पराग ट्यूब का उत्पादन किया, जो पिस्टिल संरचनाओं के माध्यम से बढ़ी। आत्म-असंगत खेती में जिसमें पराग कणों में एक एस एलील होता है जो पिस्टिल के दो एस एलील्स में से एक के साथ मेल खाता है, पराग ट्यूब शैली के ऊपरी तीसरे में बढ़ना बंद कर दिया(चित्रा 4 डी),अंडाशय और बाद के निषेचन के आगमन को रोकता है। हालांकि, जब पराग कण के एस एलील पिस्टिल के साथ अलग होते हैं, तो पराग ट्यूब शैली(चित्रा 4E)के माध्यम से बढ़ सकती है, अंडाशय(चित्रा 4F)तक पहुंच सकती है और एक अंडाशय को उर्वरित कर सकती है।

पीसीआर विश्लेषण(तालिका 1)मीठा चेरी और जापानी बेर(चित्रा 5)के एस-RNase के संरक्षित क्षेत्रों से प्राइमर का उपयोग किया गया था । उपयोग किए गए प्राइमर सेट, PruC2-PCER और PruT2-PCER (सामग्री की तालिकादेखें), प्रत्येक खेती में दोनोंएस-एलील्स के आकार को निर्धारित करने की अनुमति दी गई। प्रवर्धित टुकड़ों को इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा एगरेग्याग जेल में चलाया गया था, और विश्लेषण किए गए खेती में सात अलग-अलग एस-एलील्स(एसए, एसबी, एससी, एसई, एस एफ, एसएच, एसके)की पहचान की गई थी। टुकड़ा आकार PruC2-PCER(चित्रा5) का उपयोग कर ३९३ और १,५८० बीपी के बीच और ८२० और १,९९३ बीपी के बीच PruT2-PCER का उपयोग कर लेकर । छह एस-जीनोटाइप(एसएबीबी, एसबीएससी, एसबीएसएफ, एससीएसएच, सेश, एसएफएके)की पहचान की गई थी।

प्रत्येक खेती के फेनोलॉजी को चार साल की कुल अवधि के लिए फूलों की अवधि की लंबाई की गणना करने की अनुमति दी गई, पूर्ण खिलने पर विचार करते हुए जब अधिकांश फूल चरण एफ, चरण 65 BBCH पर थे। बाग की स्थितियों में फूल(चित्रा 6)ने खेती और वर्षों के बीच फूल के समय की तुलना की अनुमति दी, और प्रत्येक वर्ष में फूलों के समय में कौन सी खेती का निर्धारण कियाजाता है (चित्र 7)।

Figure 1
चित्रा 1: जापानी बेर में पराग निष्कर्षण। (A)बैलून स्टेज डी पर फूलों की कलियों, BAGGiolini24के अनुसार, बीबीसीएच स्केल के चरण ५७ । (ख)फूल से अडिग एंथर्स को हटाना । (ग)परागकणों को दिखाते हुए डेशीद एनथर्स । (घ)एक बारीक जाल का उपयोग करके एंथर्स से परागकणों की छलनी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: जापानी बेर में आत्म-(में) अनुकूलता निर्धारित करने के लिए हाथ परागण प्रयोग। क्षेत्र परागण:(ए)जापानी बेर में फूल, संज्ञाहरण पर फूलों के साथ और गुब्बारे के मंच पर । (ख)बैलून स्टेज डी पर फूल, बैगिओलिनी24के अनुसार, एष्टीकरण के बाद बीबीसीएच स्केल के चरण 57। (ग)कीड़ों के आने से बचने के लिए बंदी पेड़। (घ)अनुपूरक हाथ से परागण गैर-नपुंसक फूलों का । प्रयोगशाला परागण:(ई)पेडीकेल पानी के नीचे के आधार पर कटौती और भिगोए हुए फोम पर रखे फूलों को नपुंसक बनाता है। (F)बारीक तूलिका के साथ पिस्टिलियों का हाथ से परागण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: विभिन्न परागण उपचार से प्रभावित के रूप में जापानी बेर में फल ड्रॉप। नपुंसक और गैर-नपुंसक फूलों में आत्म-और क्रॉस-परागण। 'रुबिरोसा' में परागण के बाद 4 सप्ताह के दौरान पेड़ में शेष फूलों की मूल संख्या से फूलों का प्रतिशत और फल विकसित करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: पराग अंकुरण और पराग ट्यूब जापानी बेर में स्वयं परागणित फूलों में वृद्धि । (क)इन विट्रो पराग अंकुरण। (ख)विट्रो में गैर अंकुरित परागकण (तीर) । (ग)कलंक की सतह पर पराग कण अंकुरण। (घ)पराग ट्यूब शैली के ऊपरी तीसरे में गिरफ्तार । (ई)पराग ट्यूब शैली के साथ बढ़ रही है । (च)शैली के आधार पर पराग ट्यूब। स्केल बार, 200 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: नौ जापानी बेर खेती के प्राइमर सेट PruC2-PCER का उपयोग कर पीसीआर प्रवर्धन । सात एस-एलील्स(एसए, एसबी, एससी, एसई, एस एफ, एसएच, एसके)और छह एस-जीनोटाइप(एसएएसबी, एसबीएससी, एसबीएसएफ, एससीएच, एसईएच, एसएफएसके) कीपहचान। असंगति समूह (आईजी3),' फॉर्च्यून ' (एफ), ' टीसी सन ' (टीएस), ' लारोदा ' (एलआर), ' क्वीन रोजा (क्यूआर), ' रेड बेनॉट ' (आरबी), ' गोल्डन ग्लोब ' (जीजी), ' केल्सी ' (कश्मीर), निगेटिव कंट्रोल (आसुत पानी) (सी-), ' जांजी सन ' (जेडएस), ' लालेटिया ' (एलटी) । 1 केबी: आकार मानक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: जापानी बेर के फेनोलॉजी की निगरानी। विभिन्न फेनोलॉजिकल चरण में फूलों के साथ दो जापानी बेर खेती। स्टेज सी24,स्टेज 55 का बीबीसीएच स्केल (बाएं) और स्टेज एफ24,स्टेज 65 का बीबीसीएच स्केल (दाएं) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: 4 साल से अधिक चार जापानी बेर खेती में फूल समय । पहले से अंतिम खुले फूलों तक की अवधि। पीली कोशिकाएं पूर्ण खिलने के दिनों का संकेत देती हैं जिसमें अधिकांश फूल खुले थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अभिकर्मकों एक प्रतिक्रिया के अनुसार मात्रा (μL)
एच2ओ 11.50
20 एमएमएल एमजीसीएल 2 के साथ 10X बफर 2.80
डीएनटीपी मिक्स, 10 mM प्रत्येक 0.80
प्राइमर फॉरवर्ड 0.40
PruC2 (5'-CTATGGCCAAGTAATTAATTAAACC-3')40 या
प्रुट2 (5'- टीएसटीटीटीटीटी
प्राइमर रिवर्स 0.40
पीसीईआर (5'-टीजीटीटीटीसीटीसीजीसीसीटीसीसीसीसीसीसी-3')41
डीएनए टेम्पलेट 4.00
Taq डीएनए बहुलक, 500 यू 0.09
अंतिम मात्रा 20.0

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाले प्रतिक्रिया स्थितियां।

खेती(एस- जीनोटाइप) पिस्टिलों की संख्या की जांच की गई कलंक पर अंकुरित पराग कण (%) शैली के आधार पर पराग ट्यूबों के साथ पिस्टिल्स (%) शैली के आधार पर पराग ट्यूब (मतलब संख्या) स्व/क्रॉस-अनुकूलता प्रतिक्रिया
टीसी सन(एसबीएससी)× लैरी एन(एसबीएच) 22 92.3 27 1.2 +
टीसी सन(एसबीएससी)× ब्लैकअंबर(एसबीएससी) 10 74.8 0 0.0 -
टीसी सन(एसबीएससी)आत्म-परागण 44 78.3 7 1.0 +
गोल्डन बेर(SbSc)× ब्लैक स्टार(SeF) 11 64.7 36 1.5 +
गोल्डन बेर(SbSc)× टीसी सूर्य(SbSc) 11 98.4 0 0.0 -
गोल्डन बेर(ShSk)आत्म परागण 38 85.2 0 0.0 -

तालिका 2: पराग अंकुरण और पराग ट्यूब विकास स्वयं और क्रॉस-परागण के बाद दो जापानी बेर खेती के लिए शैली के माध्यम से। हाथ से परागणित पिस्टिलों की संख्या की जांच की गई, कलंक पर अंकुरित पराग कणों का प्रतिशत, शैली के आधार पर पराग ट्यूबों के साथ पिस्टाइल का प्रतिशत, शैली के आधार पर पराग ट्यूबों की औसत संख्या, स्वयं या क्रॉस-असंगत (-) और स्वयं-या क्रॉस-संगत (+)।

कलीवर अंकुरण (%) एसडी *
अर्लेमून 50 3.3
अर्लिकेन 30 4.2
एल्डोराडो 10 1.3
तपस्वी 52 2.0
गोल्डन जापान 17 3.8
गोल्डन प्लंज़ा 18 3.3
लारोदा। 46 3.6
लैरी ऐन 20 5.8
मेथले 2 0.8
ओवेन टी 16 0.3
प्राइमटाइम 20 3.3
रानी रोजा 42 3.9
रॉयल डायमंड 19 2.2
सांता रोजा 36 2.0
टीसी सूर्य 49 3.1
* एसडी = मानक विचलन

तालिका 3: 15 जापानी बेर खेती के इन विट्रो पराग अंकुरण का प्रतिशत। मतलब ± छह प्रतिकृति के एसडी।

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Discussion

जापानी प्लम खेती की परागण आवश्यकताओं के लिए यहां वर्णित पद्धति के लिए क्षेत्र या प्रयोगशाला में नियंत्रित परागण द्वारा प्रत्येक खेती की आत्म-(में) अनुकूलता का निर्धारण करने की आवश्यकता होती है, और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ पराग ट्यूब विकास के बाद अवलोकन। असंगति संबंध आणविक जेनोटाइपिंग द्वारा एस-एलील्सके लक्षण वर्णन द्वारा स्थापित किए जाते हैं। अंत में, परागणकों का चयन निगरानी फेनोलॉजी द्वारा किया जाता है ताकि उन खेती का पता लगाया जा सके जो हर साल फूलों पर मेल खाती हैं।

नई जापानी बेर-प्रकार की खेती में परागण आवश्यकताओं की स्थापना अज्ञात परागण आवश्यकताओं के साथ नई खेती की उच्च संख्या के कारण तेजी से महत्वपूर्ण होती जा रही है और उनमें से अधिकांश आत्म-असंगत3हैं। यहां वर्णित दृष्टिकोण, फेनोलॉजिकल मॉनिटरिंग, नियंत्रित परागण, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, और आणविक जीनोटाइपिंग के संयोजन से,14खेती की परागण आवश्यकताओं का निर्धारण करने में उपयोगी साबित हुआ है।

जापानी बेर संकर कई विशिष्टताओं को दिखाते हैं जो परागण आवश्यकताओं को निर्धारित करने के लिए एक दृष्टिकोण के उपयोग में बाधा डालते हैं जैसा कि अन्य प्रूनस प्रजातियों में उपयोग किया जाता है। सबसे पहले, फूल छोटे और अधिक नाजुक3हैं। पराग निष्कर्षण और हैंडलिंग अन्य प्रूनस एसपीपी के समान है।12, हालांकि अधिक संख्या में फूल एकत्र करना आवश्यक है क्योंकि एंथर्स में पराग कणों की मात्रा कम होती है3. रुबिरोसा जैसी कुछ खेती में, फूलों के नपुंसकता का उपयोग नहीं किया जा सकता है क्योंकि इस तकनीक से ओवुले डिजनरेशन22 और फूल21के बाद की बूंद होती है, जिसके परिणामस्वरूप आत्म-असंगति का झूठा निदान हो सकता है। प्रजनन उद्देश्यों के लिए, मादा माता-पिता के रूप में उपयोग की जाने वाली संवेदनशील खेती में फूलों की कमी से संतानों की कमी हो सकती है3।

फलों के पेड़ों की अन्य प्रजातियों की तुलना में फूलों की संख्या बहुत अधिक है, लेकिन फलों के सेट का प्रतिशत बहुत कमहै। इससे खेत और प्रयोगशाला दोनों परागण21 , 22के लिए अधिक संख्या में फूलों का उपयोग करना आवश्यक होजाताहै . प्रयोगशाला परागण और पराग ट्यूब विकास के बाद सूक्ष्म टिप्पणियों फसल तक क्षेत्र में हाथ से परागणित फूलों की निगरानी की तुलना में अधिक सही आत्म-(में) अनुकूलता के आकलन की अनुमति देते हैं, क्योंकि यह तकनीक पर्यावरणीय प्रभाव से बचती है और क्षेत्र प्रयोगों की तुलना में अधिक संख्या में खेती के विश्लेषण की अनुमति देती है। हालांकि, फूलों की हैंडलिंग खुबानी12जैसी अन्य प्रूनस प्रजातियों की तुलना में अधिक परिश्रमी है, क्योंकि फोम में पिस्टिल रखने से पहले पेडीकेल पानी के नीचे काटना आवश्यक है। इसके अलावा, अन्य प्रजातियों की तुलना में माइक्रोस्कोप के तहत अधिक संख्या में पिस्टिल का विश्लेषण किया जाना चाहिए, क्योंकि जापानी बेर संकर के बीच संगत पराग-पिस्टिल संबंधों में, पराग ट्यूब फूलों के कम प्रतिशत में अंडाशय तक पहुंचते हैं3। इसके अलावा, पराग ट्यूब माइक्रोस्कोप के नीचे पता लगाने के लिए अधिक कठिन हैं, और शैली के आधार तक पहुंचने वाली ट्यूबों की संख्याकम 15,18,20,28,29,30,31,32, 33,34 है . उन खेती में जिनके फूल विशेष रूप से नाजुक होते हैं और पराग ट्यूबों की शैली के आधार तक पहुंचने से पहले प्रयोगशाला की स्थिति में पतित होते हैं, स्वयं (में) अनुकूलता का मूल्यांकन क्षेत्र परागण द्वारा किया जाना चाहिए।

पराग व्यवहार्यता का मूल्यांकन यह जानने की अनुमति देता है कि क्या हाथ-परागणों में उपयोग किया जाने वाला पराग पर्याप्त है और इस प्रकार कम या शून्य अंकुरण प्रतिशत के मामलों में आत्म-असंगति के संभावित झूठे निदान को त्यागने के लिए। इस तकनीक के प्रयोग से जापानी बेर की खेती21 , 22,35के बीच पराग अंकुरण में काफी अंतर आया है . इसके अलावा, यह दृष्टिकोण पुरुष बंध्यता22,36,37का पता लगाने में भी उपयोगी है, जो वाणिज्यिक बगीचों में पराग दाताओं के रूप में पुरुष-बाँझ खेती को त्यागने और प्रजनन प्रयोजनों के लिए क्रॉस में बहुत महत्वपूर्ण है।

यद्यपि खेती के बीच असंगति संबंधों को प्रयोगशाला परागण द्वारा स्वयं-(इन) अनुकूलता मूल्यांकन के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही दृष्टिकोण का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है, लेकिन इस तकनीक के इस उद्देश्य के लिए कुछ नुकसान हैं। परागण केवल फूलों के मौसम के दौरान किया जा सकता है, और प्रयोगशाला के पास रखे वयस्क पेड़ों के साथ संग्रह या बगीचों को फूलों के संग्रह के लिए आवश्यक है, जिनकी उम्र बहुत कमहै 3,38। इसके अलावा, हर साल विश्लेषण किए गए रिश्तों की संख्या कम है, क्योंकि प्रत्येक जोड़ी की खेती के लिए एक विशेष क्रॉस-परागण की आवश्यकता होती है। एक विकल्प के रूप में, पीसीआर द्वारा एस-एलील्स की पहचान को फूलों की आवश्यकता नहीं होती है, क्योंकि डीएनए किसी भी पौधे के ऊतकों से निकाला जा सकता है; इसलिए, जिस अवधि के दौरान नमूने एकत्र किए जा सकते हैं वह लंबी है। इसके अलावा, फूलों के विपरीत जिसका तुरंत उपयोग करने की आवश्यकता होती है, पत्तियों या अन्य पौधों के ऊतकों को संग्रहीत किया जा सकता है, इसलिए विश्लेषण वसंत ऋतु में कुछ दिनों तक सीमित नहीं है, लेकिन पूरे वर्ष39में किया जा सकता है। प्राइमर सेट PruC2-PCER और PruT2-PCER40, 41 और प्रवर्धित टुकड़ों के आकार के बाद विश्लेषण का उपयोग करते हुए दूसरे एस-RNase intron के प्रवर्धन द्वारा प्रत्येक खेती के लिए दो एस-एलील्स की पहचान और प्रवर्धित टुकड़ों के आकार के बाद के विश्लेषण से जेल इलेक्ट्रोफोरेस20,21 ने खेती को उनके अनुरूप में शामिल करने की अनुमति दी (I.G.3. ). प्रत्येक I.G. एक ही दो एस-alleles, जो इसलिए अंतर असंगत है के साथ उन स्वयं असंगत खेती भी शामिल है । विभिन्न समूहों से खेती, कम से कम एक अलग एस-एलील ले जाने वाले, अंतर-संगत हैं।

इस तकनीक की सीमा है कि यह जापानी बेर की खेती के लिए आत्म-(इन) अनुकूलता के निर्धारण की अनुमति नहीं देता है क्योंकि यह अन्य प्रूनस प्रजातियों में होता है, जिसमें आत्म-अनुकूलता एक विशेष एस-एलीलके साथ जुड़ी हुई है, जैसे बादाम 42 में एसएफ और मीठेचेरी43 में एस4'। कुछ एस-एलील्सशुरू में जापानी बेर में आत्म-अनुकूलता से जुड़े थे, जैसे एसबी20,44, एसई19,20,44, एसजी45,और एसटी46। हालांकि, बाद के कार्यों ने आत्म-असंगत खेती की सूचना दी है जो इन एस-एलील्स14,20, 21,22,47को ले जाते हैं। इसलिए , जापानी बेर में एस- एलील अनुक्रमण के आगे के कार्य की आवश्यकता है ताकि यह स्पष्ट किया जा सके कि क्या एक ही आकार या उत्परिवर्तनों के विभिन्न एलील्स को गलत तरीके से एलील्स एसबी, एस ई , एसजीया एसटी3 केरूप में पहचाना गया है। इस बीच, जापानी बेर में आत्म-(in) अनुकूलता के आकलन का विश्लेषण क्षेत्र या प्रयोगशाला-परागण और क्षेत्र में फल ड्रॉप की बाद की निगरानी या माइक्रोस्कोप के नीचे पराग ट्यूबों के व्यवहार द्वारा किया जाना चाहिए।

पीसीआर विश्लेषण द्वारा एस- एलील्स की पहचान 3 खेती के बीच असंगति संबंधस्थापितकरने के लिए पर्याप्त दिखाई गई है । हालांकि, पर्याप्त परागणकों का चयन करने के लिए, इस जानकारी को कई वर्षों तक प्रत्येक क्षेत्र में प्रत्येक खेती के फूलों के समय के आंकड़ों के साथ जोड़ना आवश्यक है, क्योंकि फूलों की अवधि में बेमेल, भले ही यह केवल कुछ वर्षों में होता है, फसल14में महत्वपूर्ण कमी के साथ फल सेट की कमी हो सकती है।

फूलों के जीव विज्ञान और खेती के बीच कृषि संबंधी व्यवहार में देखे गए कई अंतर उनकी उत्पत्ति से संबंधित हो सकते हैं, क्योंकि वर्तमान में उगाए गए सभी खेती मूल प्रजातियों पी सलीना के बीच एक ही जीनस के साथ पार से प्राप्त संकर हैं, लेकिन विभिन्न विशेषताओं के साथ5,48। यह मुख्य कारण हो सकता है कि अन्य फलों की प्रजातियों के विपरीत परागण आवश्यकताओं को निर्धारित करने के लिए विभिन्न तकनीकों को जोड़ना आवश्यक है। प्रत्येक खेती की परागण आवश्यकताओं को जानने से नए बगीचों के डिजाइन के लिए खेती के पर्याप्त चयन की सुविधा मिलती है और स्थापित बगीचों में परागण की कमी से संबंधित उत्पादन समस्याओं का पता लगाने और समाधान की अनुमति मिलती है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को इंस्टीट्यूटो नैसिनल डी इन्वेस्टिगासिओन वाई टेक्नोलोगिया आगरािया वाई एलिमेंटेरिया (आरएफपी2015-00015-000-00 और RTA2017-00003-00) द्वारा वित्त पोषित किया गया था; गोबिएर्नो डी अरगोन-यूरोपीय सामाजिक कोष, यूरोपीय संघ (ग्रुपो Consolidado A12-17R), और जंटा डी एक्सट्रेमेमदुरा-फोडो यूरोपो डी डेसारलरो क्षेत्रीय (फेडरर), प्लान रीजनल डी Investigación (IB16181), ग्रुपो डी Investigación (AGA001, GR18196)। बीआई ग्युरेरो को मैक्सीको (कॉनएसवाईटी, 471839) के कोंसेजो नैसिनल डी सिएंसिया वाई टेक्नोलोगिया की फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Glacial Panreac 131008.1611
Agar iNtRON Biotechnology 25999
Aniline blue Difco 8504-88
Boric Acid (H3BO4) Panreac 131015.1210
Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) Panreac 131231.1211
Coverglass Deltalab D102460 24 mm x 60 mm
Digital Camera Imaging Developmet Systems UI-1490SE
Digital Camera Software Suite Imaging Developmet Systems 4.93.0.
DNA Oligos ThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM each ThermoSischer Scientific R0193
DreamTaq Green DNA polymerase ThermoFisher Scientific EP0713
Ethanol 96° VWR-Chemicals 83804.360
1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) Invitrogen 15615-016 Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl
Gel Documentation System Bio-Rad 1708195
Hand Counter Tamaco TM-4
Image Lab Software Bio-Rad Image Analyse System for Gel Documentation System
MetaPhor Agarose Lonza 50180
Microcentrifuge 5415 R Eppendorf Z605212
Microscope with UV epiflurescence Leica DM2500 Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425
Microslides Deltalab D100004 26 mm x 76 mm
Mini Electrophoresis System Fisherbrand 14955170
Minicentrifuge ThermoFisher Scientific 15334204
NanoDrop 1000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND1000
Petri Dishes Deltalab 200201 55 mm x 14 mm
Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) Panreac 141513
Primer forward 'Pru C2' ThermoFisher Scientific
Primer forward Pru T2' ThermoFisher Scientific
Primer reverse 'PCER' ThermoFisher Scientific
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution iNtRON Biotechnology 21141
Saccharose Panreac 131621.1211
Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) Panreac 131717.1211
Speedtools plant DNA extraction Kit Biotools 21272
TBE Buffer (10X) Panreac A0972,5000PE
Thermal Cycler T100 Bio-Rad 1861096
Thermomixer comfort Eppendorf T1317
Vertical Autoclave Presoclave II JP Selecta 4001725
Vortex Fisherbrand 11746744

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References

  1. Hendrick, U. P. The Plums of New York. , J. B. Lyon Co., State Printers. (1911).
  2. Okie, W. R., Hancock, J. F. Plums. Temperate Fruit Crop Breeding. Hancock, J. F. , Springer. Dordrecht. 337-357 (2008).
  3. Guerra, M. E., Rodrigo, J. Japanese plum pollination: a review. Scientia Horticulturae. 197, 674-686 (2015).
  4. Okie, W. R. Introgression of Prunus species in plum. New York Fruit Quarterly. 14 (1), 29-37 (2006).
  5. Okie, W. R., Weinberger, J. H. Fruit Breeding, vol. 1. Tree and tropical fruits. Janick, J., Moore, J. , John Wiley and Sons Inc. New York. 559-608 (1996).
  6. Mccubbin, A. G., Kao, T. Molecular recognition and response in pollen and pistil interactions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 333-364 (2000).
  7. Hegedűs, A., Halász, J. Recent findings of the tree fruit self-incompatibility studies. International Journal of Horticultural Science. 13 (2), 7-15 (2007).
  8. de Nettancourt, D. Incompatibility and Incongruity in Wild and Cultivated Plants. , Springer-Verlag. Berlín. (2001).
  9. Tao, R., et al. Identification of stylar RNases associated with gametophytic self-incompatibility in almond (Prunus dulcis). Plant and Cell Physiology. 38 (3), 304-311 (1997).
  10. Halász, J., Pedryc, A., Ercisli, S., Yilmaz, K., Hegedűs, A. S-genotyping supports the genetic relationships between Turkish and Hungarian apricot germplasm. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (5), 410-417 (2010).
  11. Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Self-incompatibility and S-allele identification in new apricot cultivars. Acta Horticulturae. (1231), 171-176 (2019).
  12. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
  13. Cachi, A. M., Wunsch, A. Characterization of self-compatibility in sweet cherry varieties by crossing experiments and molecular genetic analysis. Tree Genetics & Genomes. 10, 1205-1212 (2014).
  14. Guerra, M. E., Guerrero, B. I., Casadomet, C., Rodrigo, J. Self-compatibility, S-RNase allele identification, and selection of pollinizers in new Japanese plum-type cultivars. Scientia Horticulturae. 261, 109022 (2020).
  15. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 1-12 (2018).
  16. Herrera, S., Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Lora, J. Identification of self-incompatibility alleles by specific PCR analysis and S-RNase sequencing in apricot. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3612 (2018).
  17. Sociasi Company, R., Kodad, O., Fernández i Martí, J. M., Alonso, J. M. Mutations conferring self-compatibility in Prunus species: from deletions and insertions to epigenetic alterations. Scientia Horticulturae. 192, 125-131 (2015).
  18. Rodrigo, J., Herrero, M. Evaluation of pollination as the cause of erratic fruit set in apricot 'Moniqui. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 71 (5), 801-805 (1996).
  19. Beppu, K., et al. Se-haplotype confers self-compatibility in Japanese plum (Prunus salicina Lindl). Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 80 (6), 760-764 (2005).
  20. Guerra, M. E., Rodrigo, J., López-Corrales, M., Wünsch, A. S-RNase genotyping and incompatibility group assignment by PCR and pollination experiments in Japanese plum. Plant Breeding. 128 (3), 304-311 (2009).
  21. Guerra, M. E., Wunsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Flower emasculation as the cause for lack of fruit set in Japanese plum crosses. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (6), 556-562 (2010).
  22. Guerra, M. E., Wünsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Lack of fruit set caused by ovule degeneration in Japanese plum. Journal of the American Society for Horticultural Science. 136 (6), 375-381 (2011).
  23. Fernández i Martí, A., Gradziel, T. M., Socias i Company, R. Methylation of the Sf locus in almond is associated with S-RNase loss of function. Plant Molecular Biology. 86, 681-689 (2014).
  24. Baggiolini, M. Les stades repérés des arbres fruitiers à noyau. Revue romande d'Agriculture et d'Arboriculture. 8, 3-4 (1952).
  25. Meier, U. Growth stages of mono-and dicotyledonous plants: BBCH Monograph. Federal Biological Research Centre for Agriculture and Forestry. , (2001).
  26. Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Flower development in sweet cherry framed in the BBCH scale. Scientia Horticulturae. 192, 141-147 (2015).
  27. Fadon, E., Rodrigo, J. Combining histochemical staining and image analysis to quantify starch in the ovary primordia of sweet cherry during winter dormancy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
  28. Hormaza, J. I., Pinney, K., Polito, V. S. Correlation in the tolerance to ozone between sporophytes and male gametophytes of several fruit and nut tree species (Rosaceae). Sexual Plant Reproduction. 9, 44-48 (1996).
  29. Burgos, L., et al. The self-compatibility trait of the main apricot cultivars and new selections from breeding programmes. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 72 (1), 147-154 (1997).
  30. Dicenta, F., Ortega, E., Cánovas, J. A., Egea, J. Self-pollination vs. cross-pollination in almond: pollen tube growth, fruit set and fruit characteristics. Plant Breeding. 121, 163-167 (2002).
  31. Alonso, J. M., Socias i Company, R. Differential pollen tube growth in inbred self-compatible almond genotypes. Euphytica. 144, 207-213 (2005).
  32. Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. The effect of temperature on pollen germination, pollen tube growth, and stigmatic receptivity in peach. Plant Biology. 7, 476-483 (2005).
  33. Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. Warm temperatures at bloom reduce fruit set in sweet cherry. Journal of Applied Botany. 81, 158-164 (2007).
  34. Milatović, D., Nikolić, D. Analysis of self-(in)compatibility in apricot cultivars using fluorescence microscopy. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 82, 170-174 (2007).
  35. Jia, H. J., He, F. J., Xiong, C. Z., Zhu, F. R., Okamoto, G. Influences of cross pollination on pollen tube growth and fruit set in Zuili plums (Prunus salicina). Journal of Integrative Plant Biology. 50, 203-209 (2008).
  36. Herrero, M., Salvador, J. La polinización del ciruelo Red Beaut. Información Técnica Econónomica Agraria. 41, 3-7 (1980).
  37. Ramming, D. W. Plum. Register of new fruit and nut varieties: Brooks and Olmo, List 37. HortScience. 30 (6), 1142-1144 (1995).
  38. Hartmann, W., Neümuller, M. Plum breeding. Breeding plantation tree crops: Temperate species. , Springer. New York, NY. 161-231 (2009).
  39. Guerra, M. E., López-Corrales, M., Wünsch, A. Improved S-genotyping and new incompatibility groups in Japanese plum. Euphytica. 186 (2), 445-452 (2012).
  40. Tao, R., et al. Molecular typing of S-alleles through identification, characterization and cDNA cloning for S-RNases in sweet cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science. 124 (3), 224-233 (1999).
  41. Yamane, H., Tao, R., Sugiura, A., Hauck, N. R., Lezzoni, A. F. Identification and characterization of S-RNases in tetraploid sour cherry (Prunus cerasus). Journal of the American Society for Horticultural Science. 126, 661-667 (2001).
  42. López, M., Jose, F., Vargas, F. J., Battle, I. Self-(in)compatibility almond genotypes: a review. Euphytica. 150, 1-16 (2006).
  43. Bošković, R., Tobutt, K. R. Correlation of stylar ribonuclease zymograms with incompatibility alleles in sweet cherry. Euphytica. 90, 245-250 (1996).
  44. Beppu, K., Syogase, K., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Inheritance of self-compatibility conferred by the Se-haplotype of Japanese plum and development of Se-RNase gene-specific PCR primers. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 85, 215-218 (2010).
  45. Beppu, K., Kumai, M., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Molecular and genetic analyses of the S-haplotype of the self-compatible Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) "Methley". Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 87 (5), 493-498 (2012).
  46. Beppu, K., Konishi, K., Kataoka, I. S-haplotypes and self-compatibility of the Japanese plum cultivar 'Karari'. Acta Horticulturae. 929, 261-266 (2012).
  47. Sapir, G., Stern, R. A., Shafir, S., Goldway, M. S-RNase based S-genotyping of Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) and its implication on the assortment of cultivar-couples in the orchard. Scientia Horticulturae. 118, 8-13 (2008).
  48. Karp, D. Luther Burbank's plums. HortScience. 50 (2), 189-194 (2015).

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फिनोलॉजिकल मॉनिटरिंग, हैंड परागण, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और मॉलिक्यूलर जेनोटीपिंग द्वारा जापानी बेर में परागण आवश्यकताओं की स्थापना
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Guerrero, B. I., Guerra, M. E.,… More

Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping. J. Vis. Exp. (165), e61897, doi:10.3791/61897 (2020).

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