Maximale isometrische tetanische Kraftmessung des Tibialis-Vordermuskels bei ratten
Summary
Die Bewertung der motorischen Erholung bleibt das Benchmark-Ergebnismaß in experimentellen peripheren Nervenstudien. Die isometrische tetanische Kraftmessung des Tibialis-Vordermuskels bei der Ratte ist ein unschätzbares Werkzeug, um funktionelle Ergebnisse nach der Rekonstruktion von Ischiasnervendefekten zu beurteilen. Die Methoden und Nuancen werden in diesem Artikel ausführlich beschrieben.
Abstract
Traumatische Nervenverletzungen führen zu einem erheblichen Funktionsverlust und segmentale Nervendefekte erfordern oft die Verwendung von autologen Interpositionsnerventransplantaten. Aufgrund ihrer begrenzten Verfügbarkeit und der damit verbundenen komorischen Morbidität auf der Spenderseite konzentrieren sich viele Studien im Bereich der Nervenregeneration auf alternative Techniken, um eine segmentale Nervenlücke zu überbrücken. Um die Ergebnisse chirurgischer oder pharmakologischer experimenteller Behandlungsmöglichkeiten zu untersuchen, wird das Ischiasnervenmodell der Ratte häufig als Bioassay verwendet. Es gibt eine Vielzahl von Ergebnismessungen, die in Rattenmodellen verwendet werden, um das Ausmaß der Nervenregeneration zu bestimmen. Die maximale Ausstoßkraft des Zielmuskels bleibt das relevanteste Ergebnis für die klinische Translation experimenteller Therapien. Die isometrische Kraftmessung der tetanischen Muskelkontraktion wurde zuvor als reproduzierbare und gültige Technik zur Bewertung der motorischen Erholung nach Nervenverletzungen oder -reparaturen in Ratten- und Kaninchenmodellen beschrieben. In diesem Video geben wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zu diesem unschätzbaren Verfahren zur Beurteilung der funktionellen Erholung des Tibialis-Vordermuskels in einem Ischiasnervendefektmodell der Ratte unter Verwendung optimierter Parameter. Wir werden die notwendigen präoperativen Vorbereitungen zusätzlich zum chirurgischen Ansatz und der Dissektion des gemeinsamen Peronealnervs und der Tibialis anteriorEnmuskelsehne beschreiben. Die isometrische tetanische Kraftmesstechnik wird detailliert beschrieben. Die Bestimmung der optimalen Muskellänge und Reizpulsfrequenz wird erläutert und die Messung der maximalen tetanischen Muskelkontraktion demonstriert.
Introduction
Der Verlust der motorischen Funktion nach einer traumatischen peripheren Nervenverletzung hat einen signifikanten Einfluss auf die Lebensqualität und den sozioökonomischen Status der Patienten1,2,3. Die Prognose dieser Patientenpopulation bleibt aufgrund minimaler Verbesserungen der Operationstechniken im Laufe der Jahre schlecht4. Die direkte, spannungsfreie Epineuralreparatur bildet die chirurgische Rekonstruktion nach Goldstandard. In Fällen mit ausgedehnten Nervenlücken hat sich jedoch die Interposition eines autologen Nerventransplantats als überlegen erwiesen5,6. Die damit verbundene Morbidität an der Spenderstelle und die begrenzte Verfügbarkeit von autologen Nerventransplantaten haben die Notwendigkeit alternativer Techniken erforderlich erklärt7,8.
Experimentelle Tiermodelle wurden verwendet, um den Mechanismus der peripheren Nervenregeneration aufzuklären und die Ergebnisse einer Vielzahl von rekonstruktiven und pharmakologischen Behandlungsmöglichkeiten zu bewerten8,9. Das Ischiasnervenmodell der Ratte ist das am häufigsten verwendete Tiermodell10. Ihre geringe Größe macht sie einfach zu handhaben und zu beherbergen. Aufgrund ihres superlativen neuroregenerativen Potenzials kann die verminderte Zeit zwischen Intervention und Bewertung der Ergebnisse zu relativ niedrigeren Kosten führen11,12. Weitere Vorteile seiner Verwendung sind morphologische Ähnlichkeiten mit menschlichen Nervenfasern und die hohe Anzahl vergleichender/historischer Studien13. Letzteres sollte zwar vorsichtig angegangen werden, da eine Vielzahl unterschiedlicher Ergebnismessungen zwischen den Studien den Vergleich der Ergebnisse erschwert14,15,16,17,18.
Die Ergebnismessungen zur Beurteilung der Nervenregeneration reichen von der Elektrophysiologie bis zur Histomorphometrie, aber diese Methoden implizieren eine Korrelation, messen aber nicht unbedingt direkt die Rückkehr der motorischen Funktion14,15. Regenerierende Nervenfasern stellen möglicherweise keine geeigneten Verbindungen her, was zu einer Überschätzung der Anzahl der funktionellen Verbindungen führen kann14,15,19,20. Die beste und klinisch relevanteste Messung zum Nachweis der korrekten Reinnervation von Endorganen bleibt die Beurteilung der Muskelfunktion21,22,23. Die Erstellung von Werkzeugen zur Bewertung der motorischen Funktion für Tiermodelle ist jedoch eine Herausforderung. Medinaceli et al. beschrieben erstmals die Walking-Track-Analyse, die seitdem die am häufigsten verwendete Methode zur Bewertung der funktionellen Erholung in experimentellenperipherenNervenstudienist 21,24,25,26,27,28. Die Walking-Track-Analyse quantifiziert den Ischiasfunktionsindex (SFI) basierend auf Messungen von Pfotenabdrücken von gehenden Ratten21,29. Wesentliche Einschränkungen der Laufweganalyse, wie Zehenkontrakturen, Autoverstümmelung, Verschmieren des Drucks und schlechte Korrelation mit anderen Messungen der Reinnervation, haben die Verwendung anderer Parameter zur Quantifizierung der funktionellen Erholungerforderlich 30,31.
In früheren Studien an Lewis-Ratten32 und neuseeländischen Kaninchen33haben wir die isometrische Tetanic Force (ITF)-Messung für den Tibialis anterior (TA) Muskel validiert und ihre Wirksamkeit bei der Bewertung der Muskelregeneration nach verschiedenen Arten der Nervenreparatur34,35,36,37,38,39nachgewiesen . Der TA-Muskel ist wegen seiner relativ großen Größe, Innervation durch den peronealen Ast des Ischiasnervs und gut aufgeklärten biochemischen Eigenschaften gut geeignet40,41,42,43. Wenn die Muskellänge (Vorspannkraft) und die elektrischen Parameter optimiert werden, bietet die ITF eine Side-to-Side-Variabilität von 4,4% bzw. 7,5% bei Ratten32 bzw. Kaninchen33.
Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll der ITF-Messung im Ischiasnervmodell der Ratte, einschließlich einer gründlichen Beschreibung der notwendigen präoperativen Planung, des chirurgischen Ansatzes und der Dissektion des gemeinsamen Peronealnervs und der distalen TA-Muskelsehne. Anhand vorgegebener Werte für die Reizintensität und -dauer wird die optimale Muskellänge und Reizpulsfrequenz definiert. Mit diesen vier Parametern kann die ITF anschließend konsistent und genau gemessen werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine zuvor validierte Methode zur Erfassung genauer maximaler ITF-Messungen des TA-Muskels im Rattenmodell32. Die Wiederherstellung der Maximalen Kraft nach experimentellen Nervenrekonstruktionsbehandlungen ist im klinischen Umfeld von primärem Interesse, da sie beweist, dass sich der Nerv nicht nur regenerierte, sondern auch Arbeitsverbindungen mit dem Zielmuskel einstellte. Die ITF kann in einem kleinen Nervenlückenmodell wie dem Ischiasnervmodell3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke der National Institutes of Health unter der Vergabenummer RO1 NS 102360 unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride | Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA | G130203 | |
| 1 mm Kirshner wires | Pfizer Howmedica, Rutherford, NJ | N/A | |
| Adson Tissue Forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | MTK-6801226 | |
| Bipolar electrode cables | Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
| Bipolar stimulator device | Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
| Cotton-tip Applicators | Cardinal Health, Waukegan, IL, USA | C15055-006 | |
| Curved Mosquito forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | MTK-1201112 | |
| Force Transducer MDB-2.5 | Transducer Techniques, Temecula, CA | N/A | |
| Gauze Sponges 4×4 | Covidien, Mansfield, MA, USA | 2733 | |
| Ground cable | Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
| Isoflurane chamber | N/A | N/A | Custom-made |
| Ketamine | Ketalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ | 42023-115-10 | |
| LabView Software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Loop | N/A | N/A | Custom-made |
| Microsurgical curved forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | JFA-5B | |
| Microsurgical scissors | ASSI, Westbury, NY, USA | SAS-15R-8-18 | |
| Microsurgical straight forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | JF-3 | |
| Retractor | ASSI, Westbury, NY, USA | AG-124426 | |
| Scalpel Blade No. 15 | Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA | 371115 | |
| Slim Body Skin Stapler | Covidien, Mansfield, MA, USA | 8886803512 | |
| Subminiature electrode | Harvard Apparatus, Holliston, MA | N/A | |
| Surgical Nerve Stimulator | Checkpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA | 9094 | |
| Terrell Isoflurane | Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA | H961J19A | |
| Testing platform | N/A | N/A | Custom-made |
| Tetontomy Scissors | ASSI, Westbury, NY, USA | ASIM-187 | |
| Traceable Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S407992 | |
| USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) device | National Instruments, Austin, TX | 779026-01 | |
| Vacuum Base Holder | Noga Engineering & Technology Ltd., Shlomi, Isreal | N/A | Attached clamp is custom-made |
| Weight (10 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820010.4 | |
| Weight (20 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820020.4 | |
| Weight (50 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820050.4 | |
| Xylazine | Xylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada | 1XYL002 |
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