Summary
Motor geri kazanımın değerlendirilmesi deneysel periferik sinir çalışmalarında kıyaslama sonucu ölçüsü olmaya devam etmektedir. Sıçandaki tibialis ön kasının izometrik tetanik kuvvet ölçümü, siyatik sinir kusurlarının yeniden yapılandırılmasından sonra fonksiyonel sonuçları değerlendirmek için paha biçilmez bir araçtır. Yöntemler ve nüanslar bu makalede ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Abstract
Travmatik sinir yaralanmaları önemli fonksiyonel kayıplara neden olmakta ve segmental sinir defektleri genellikle otolog interpozisyon sinir greftlerinin kullanılmasını gerektirmektedir. Sınırlı mevcudiyeti ve ilişkili donör yan morbiditesi nedeniyle, sinir yenilenmesi alanındaki birçok çalışma segmental sinir boşluğunun kapatılması için alternatif tekniklere odaklanmaktadır. Cerrahi veya farmakolojik deneysel tedavi seçeneklerinin sonuçlarını araştırmak için, sıçan siyatik sinir modeli genellikle biyoassay olarak kullanılır. Sinir yenilenmesinin boyutunu belirlemek için sıçan modellerinde kullanılan çeşitli sonuç ölçümleri vardır. Hedef kasın maksimum çıkış kuvveti deneysel tedavilerin klinik çevirisi için en uygun sonuç olmaya devam etmektedir. Tetanik kas kasılmasının izometrik kuvvet ölçümü daha önce hem sıçan hem de tavşan modellerinde sinir yaralanması veya onarımı sonrası motor iyileşmeyi değerlendirmek için tekrarlanabilir ve geçerli bir teknik olarak tanımlanmıştır. Bu videoda, optimize edilmiş parametreler kullanılarak bir sıçan siyatik sinir kusuru modelinde tibialis ön kasının fonksiyonel iyileşmesinin değerlendirilmesi için bu paha biçilmez prosedürün adım adım talimatını sağlayacağız. Ortak peroneal sinir ve tibialis ön kas tendonunun cerrahi yaklaşımına ve diseksiyona ek olarak gerekli ameliyat öncesi hazırlıkları açıklayacağız. İzometrik tetanik kuvvet ölçüm tekniği detaylandırılacaktır. Optimal kas uzunluğunun ve uyaran nabız frekansinin belirlenmesi açıklanır ve maksimum tetanik kas kasılmasının ölçülmesi gösterilmiştir.
Introduction
Travmatik periferik sinir hasarı sonrasında motor fonksiyon kaybı hastaların yaşam kalitesi ve sosyoekonomik durumu üzerinde önemli bir etkiye sahiptir1,2,3. Bu hasta popülasyonunun prognozu, cerrahi tekniklerde yıllar içinde en az iyileşme nedeniyle zayıf kalmaktadır4. Doğrudan uç-uç gerilimsiz epineural onarım, altın standart cerrahi rekonstrüksiyonu oluşturur. Bununla birlikte, otolog bir sinir greftinin uzun sinir boşlukları interpozisyonunun olduğu durumlarda üstün olduğu kanıtlanmıştır5,6. İlişkili donör bölgesi morbiditesi ve otolog sinir greftlerinin sınırlı mevcudiyeti alternatif tekniklere ihtiyaç getirmiştir7,8.
Deneysel hayvan modelleri periferik sinir rejenerasyon mekanizmasını aydınlatmak ve çeşitli rekonstrüktif ve farmakolojik tedavi seçeneklerinin sonuçlarını değerlendirmek için kullanılmıştır8,9. Sıçan siyatik sinir modeli en sık kullanılan hayvan modelidir10. Küçük boyutları onları idare etmeyi ve barındırmayı kolaylaştırır. Üstün nörojeneratif potansiyelleri nedeniyle, müdahale ve sonuçların değerlendirilmesi arasındaki sürenin azalması nispeten daha düşük maliyetlere neden olabilir11,12. Kullanımının diğer avantajları arasında insan sinir lifleri ile morfolojik benzerlikler ve karşılaştırmalı /tarihi çalışmaların yüksek sayısı13. İkincisine dikkatli yaklaşılması gerekmesine rağmen, çalışmalar arasındaki çok çeşitli farklı sonuç önlemleri sonuçları karşılaştırmayı zorlaştırdığından14 , 15,16,17,18.
Sinir rejenerasyonunu değerlendirmek için sonuç önlemleri elektrofizyolojiden histomomorfolojiye kadar uzanır, ancak bu yöntemler bir korelasyon anlamına gelmez, ancak motor fonksiyonun geri dönüşünü doğrudan ölçmez14,15. Sinir liflerinin yenilenmesi, fonksiyonel bağlantı sayısının 14 , 15,19,20'nin fazla tahmin edilmesine neden olabilecek uygun bağlantılar kuramayabilir. Son organların doğru reinnervasyonunu göstermek için en iyi ve klinik olarak en alakalı ölçüm kas fonksiyonu21 , 22,23' ün değerlendirilmesine devam etmektedir. Bununla birlikte, hayvan modelleri için motor fonksiyon değerlendirme araçları oluşturmak zordur. Medinaceli ve ark. ilk olarak deneysel periferik sinir çalışmalarında fonksiyonel iyileşmeyi değerlendirmek için en sık kullanılan yöntem olan yürüyüş parkuru analizini tanımladı21 , 24,25,26,27,28. Yürüyüş yolu analizi, yürüyen sıçanlardan gelen pençe izlerinin ölçümlerine dayanarak siyatik fonksiyonel indeksi (SFI) ölçen21,29. Ayak baş parmak kontrtrüktürleri, otomutilasyon, baskının lekelenmesi ve diğer reennervasyon önlemleriyle zayıf korelasyon gibi yürüyüş parkuru analizinin büyük sınırlamaları, fonksiyonel iyileşmenin nicelemesi için diğer parametrelerin kullanılmasını zorunlu kılmış30,31.
Lewis sıçanlar32 ve Yeni Zelanda tavşanları33önceki çalışmalarda, tibialis ön (TA) kası için izometrik tetanik kuvvet (ITF) ölçümünü doğruladık ve farklı sinir onarımı 34 , 35, 36,37,38,39türlerinden sonra kas iyileşmesinin değerlendirilmesinde etkinliğini gösterdik. TA kası, nispeten büyük boyutu, siyatik sinirin peroneal dalı tarafından innervasyonu ve iyi aydınlanmış biyokimyasal özellikleri nedeniyle çok uygundur40,41,42,43. Kas uzunluğu (ön yük kuvveti) ve elektrik parametreleri optimize edildiğinde ITF, sıçan 32 ve tavşan33'te sırasıyla% 4.4 ve% 7.5 arasında yan yana değişkenlik sağlar.
Bu makalede, sıçan siyatik sinir modelinde ITF ölçümünün, gerekli ameliyat öncesi planlamanın, cerrahi yaklaşımın ve yaygın peroneal sinirin ve distal TA kas tendonunun diseksiyonunun kapsamlı bir açıklaması da dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokolü sağlanmıştır. Uyaran yoğunluğu ve süresi için önceden belirlenmiş değerler kullanılarak, en uygun kas uzunluğu ve uyaran darbe frekansı tanımlanacaktır. Bu dört parametre ile ITF daha sonra tutarlı ve doğru bir şekilde ölçülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan işlemleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC A334818) onayı ile gerçek gerçekleştirildi.
1. Kuvvet dönüştürücünün kalibrasyonu
- Bilgisayarın USB-6009 çok işlevli I/O veri toplama (DAQ) aygıtına düzgün bir şekilde bağlandığından emin olun, bu da kuvvet dönüştürücüye bağlanmalıdır.
NOT: Diğer sıçan suşları ve türleri, daha yüksek kuvvetler beklendiğinden farklı bir yük hücresi kuvvet dönüştürücüsü gerektirebilir 44. - Modifiye cerrahi hemostattan vakum tabanı ayarlanabilir kol koluna monte edilen kuvvet dönüştürücüye özel bir kelepçe takın.
NOT: Özel yapım kelepçe, gerilimin ayarını sağlayan bir sıkma vidası ile modifiye edilmiş cerrahi bir hemostattan oluşur (Şekil 1). - Sıçan arka uzvu sabitlemek için iki ahşap blok içeren özel yapım akrilik cam test platformunu masaya yerleştirin.
NOT: K-telleri nüfuz edebildiği ve sabitleyebildiği sürece ahşap yerine üretan gibi diğer malzemeler de kullanılabilir. - Kelepçeyi, kuvvet dönüştürücüsünü ve ayarlanabilir kol kolu kombinasyonunu vakum tabanını kullanarak test platformuna dikey olarak takın.
- Kalibrasyon ağırlıkları için bir kancayı veya halkayı kelepçeye bağlayın.
- Bilgisayarı açın ve yazılımı açın (örneğin, LabVIEW).
- Yazılım açıldıktan sonra, ITF ölçümü için özel yapım sanal cihazı (VI) başlatın (Şekil 2).
NOT: Şekil 2, LabVIEW kodunu bir VI snippet'inde içerir. Bu VI snippet, LabVIEW'deki blok diyagramına sürüklenebilir. Otomatik olarak grafik koduna dönüştürülür. Bu deneme için örnekleme oranı 2000 Hz olarak ayarlanmıştır ve her yineleme için okunacak 25 örnek bulunmaktadır. - Sol üst köşedeki beyaz oka basarak VI'yı çalıştırın ve Yeni kalibrasyon 'useçin. Yeni bir pencere açılacak.
- Kalibrasyon işlemini sıfır ağırlıkla başlatın (sadece bağlı kancalı veya halkalı kelepçe) ve Tamam'abasın.
- Ardışık olarak, 10, 20, 30 ve 50 gram ağırlık ekleyin ve her ağırlık ölçümü arasında Tamam'a basın.
- Beş ölçüm de toplandıktan sonra İşlem'e tıklayın.
- Değerleri yalnızca VI'daki grafik pozitif doğrusal eğri görüntülerse kabul edin (Şekil 3).
- Kelepçeyi, kuvvet dönüştürücüslerini ve ayarlanabilir kol kolu kombinasyonunu test platformunda yatay olarak yeniden konumlandırın. Bu, ITF'yi ölçmek için kullanılan konum olacaktır.
- Sıfır'a tıklanın, pencere otomatik olarak kapanacaktır.
2. Hayvan denekleri
- 300-500 g ağırlığında erkek Lewis sıçanları kullanın.
NOT: Sinir yenilenmesinin karşılaştırılması için, aynı sıçan suşunu hem kontrol hem de deneysel gruplarda kullanmak zorunludur, çünkü ağırlık ve ototomi insidansı zorlanmaya bağlıdır ve ITF10,32, 45,46,47sonuçlarını muazzam derecede etkileyebilir.
3. Cerrahi hazırlık
- Ameliyattan önce gerekli tüm cerrahi aletlerihazırlayın( Malzeme Masası ).
- Gerekli anestezi miktarını belirlemek için hayvanları tartın.
- Sıçanı oksijende% 3 izofluran ile gazlanmış bir odaya yerleştirerek anesteziye neden olabilir.
- Intraperitoneal enjeksiyon yoluyla 1 mL/ kg vücut ağırlığı dozajda on parçalı ketamin (100 mg / mL) ve bir parçalı ksilazin (100 mg / mL) kokteyli kullanarak sıçanı derinlemesine uyuşturun. Bir parmak sıkışmasına verilen tepkiye dayanarak ve solunum hızını gözlemleyerek anestezinin derinliğini izleyin.
- Ketamin / ksilazin kokteylinin ilk dozajından yaklaşık 30 dakika sonra, düşük solunum hızı ve bir toe kıskacına yanıt olarak tanımlanan tüm prosedür boyunca yeterli anesteziyi korumak için intraperitoneal olarak sadece ketamin (100 mg / mL) vücut ağırlığında 0.3-0.6 mL / kg ek bir doz uygulayın.
DİkKAT: Aşırı dozda önlem alınamayacağından gerekli anestezinin titizlikle uygulanması önemlidir. - Elektrikli makas kullanarak sıçanın arka uzuvlarını dikkatlice tıraş edin.
- Vücut sıcaklığını 37 °C'de tutmak için sıçanı bir ısıtma yastığına eğilimli bir konuma yerleştirin. İsteğe bağlı olarak, vücut sıcaklığı bir rektal termometre kullanılarak izlenebilir.
- İşlem boyunca yeterli hidrasyon durumunu korumak için sıçanın boynundaki gevşek cilde 5 mL% 0.9 sodyum klorür (NaCl) deri altından enjekte edin.
- Bu işlemin sağkalım olmaması nedeniyle cerrahi alan ve aletlerin steril olması gerekmez. Anatomik yapıların uygun şekilde görselleştirilmesi için cerrahın kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanması ve cerrahi loupes kullanılması önerilir.
4. Ortak peroneal sinire cerrahi yaklaşım
- Sıçanı, önce hangi tarafın ölçüleceğine bağlı olarak sağ veya sol yanal recumbent pozisyonuna yerleştirin.
- 15 numaralı cerrahi bıçağı kullanarak büyük trokanterden başlayarak uyluk kemiğine paralel posterolateral uyluğun derisinde 2-3 cm'lik bir kesi oluşturun.
- Pazı femoris kası ile gluteus maximus ve vastus lateralis kasları arasındaki düzlemi tanımlayın ve bu kasları ayırmak ve alttaki siyatik siniri ortaya çıkarmak için tenotomi makası kullanarak künt bir diseksiyon gerçekleştirin.
- Siyatik sinirin trifurkasyonunun yerini tespit edin ve daha iyi erişim elde etmek için bir retraktör yerleştirin. Siyatik sinirin üç dalı ortak peroneal sinir, tibialis siniri ve sural siniri içerir.
- Eğri bir mikrocerrahi tostipi kullanarak siyatik sinirin ortak peroneal sinir dalını (genellikle en ventral dal) izole edin.
NOT: Belirsizlik durumunda, izole edilmiş siniri cerrahi bir sinir stimülatörü ile hafifçe uyarın ve motor yanıtı gözlemleyin. Yaygın peroneal sinirin uyarılması pençenin dorsiflexion ile sonuçlanır.
5. Distal tibialis ön kas tendonunun diseksiyonu
- TA kasını ve yerleştirilmesini ortaya çıkarmak için, cildi alt bacağın anterolateral yönünde, diz eklemden başlayarak ve arka pençenin vasat tarafına inerek indirgeyin.
- Distal TA kas tendonu çevre dokudan 15 numaralı cerrahi bıçakla neşter kullanarak parçalara ayrıştırın.
- Bir sivrisinek toparlaklarını kullanarak, TA kas tendonunu ekleme doğru açıkça parçalara bölün ve tendonu mümkün olduğunca distal kesin. Proksimal TA kasını bozulmadan bırakın, nörovasküler pedikülleri koruyarak.
NOT: Düzenli olarak (yaklaşık her 5 dakikada bir), soğutma ve desiccation önlemek için ısıtmalı% 0.9 NaCl (37 °C) ile TA kas nemli.
6. İzometrik tetanik kuvvet ölçümü
- Bipolar elektrot kablolarını ve zemin kablosunu renklerine göre bipolar bir uyarıcı cihaza bağlayın.
- Bipolar elektrot kablolarının diğer ucını bir altmiature elektroduna takın.
NOT: Referans elektrot (kırmızı, anot) distal ve aktif elektrot (siyah, katot) proksimal yerleştirilmelidir. - Hayvanı ısıtma yastığı ile birlikte test platformuna aktarın.
- Farenin arka uzuvlarını ayak bileğinden iki adet 1 mm Kirschner teli ve diz arka yönünden kaçınarak distal femurun lateral kondyle'u kullanarak ahşap bloğa sabitleyin.
DİkKAT: Uyluk kemiğine dorsally olarak yerleştirilen popliteal arter ve damarda damar hasarından kaçının. - Vakum tabanını kullanarak test platformuna özel bir kelepçe ile bir tutucu takın.
- Distal TA kas tendonını kuvvet dönüştürücüye bağlı kelepçeye sabitleyin.
NOT: Kelepçe ve kuvvet dönüştürücü, TA kasının seyrine paralel olarak konumlandırılmalıdır. - Ortak peroneal sinire erişmek için retraktörü sıçanın posterolateral uyluğuna yerleştirin.
NOT: Siyatik siniri ve dalları, soğutma ve desiccation önlemek için ısıtılmış% 0.9 NaCl (37 °C) ile nemli tutulmalıdır. - Zemin kablosunu çevredeki kaslara takın (örneğin, vastus lateralis kası).
NOT: Grass SD9 stimülatör, elektriksel eserleri azaltmak için bir zemin kablosu gerektirir. Yeni uyarıcılar ekstra bir yer kablosu gerektirmeyebilir. - Ortak peroneal siniri subminiature elektroduna bağlayın ve platformdaki tutucuyu kullanarak konumunu sabitle(Şekil 4).
NOT: Sadece ortak peroneal sinirin subminiature elektrot'a takıldığından emin olun. - Kas uzunluğunun optimizasyonu
- Bipolar uyarıcı cihazı açın ve ayarları aşağıdaki gibi ayarlayın: kare monofazik nabız, gecikme 2 ms, uyaran darbe süresi 0.4 ms, uyaran yoğunluğu 2 V.
NOT: Gecikme, senkronizasyon darbesi ile darbenin öncü kenarının teslimi arasındaki süreyi belirler. - Parametre testi'ni seçin ve VI'da Tetikleyici koleksiyonunu açın.
- Kuvvet dönüştürücüye bağlı kol kolunu ayarlayarak kas uzunluğunu (ön yük) artırın.
- 10 g ön yüklemeden başlayın ve maksimum aktif kas kuvveti belirlenene kadar 10 g'lı artışlar kullanın.
- Her ön yükleme için, bipolar stimülatör cihazındaki düğmeyi kullanarak doğrudan birbiri ardına iki tek seğirme uygulayın. Çıkış ekranda görülebilir ve sıçan pençenin dorsiflexionunu göstermelidir.
NOT: Siniri uyarmadan önce, sinyalin çevredeki dokuya iletilmediğinden emin olmak için pamuk uçlu aplikatörler kullanarak siniri çevreleyen fazla % 0,9 NaCl'yi her zaman çıkarın. - Ölçümü durdurmak için VI'da Tetikleyici koleksiyonuna tekrar basın.
- Program iki tepe çıkış kuvvetini otomatik olarak algılarsa Kabul Et'i tıklatın. Programın bu çıkış kuvvetlerini otomatik olarak seçmemesi durumunda, Reddet tuşuna basın ve tepeleri el ile seçin. İki tepe çıkış kuvveti ortalama bir tepe çıkış kuvvetine göre ortalama olarak elde edilecektir (Şekil 5).
- Ortalama tepe çıkış kuvvetinden ön yükü çıkararak aktif kas kuvvetini hesaplayın.
- Trendi görselleştirmek ve maksimum aktif kuvveti tanımak için her ön yükleme için aktif kuvveti yazın (Şekil 6). Elektronik tablo da kullanılabilir.
- Bipolar uyarıcı cihazı açın ve ayarları aşağıdaki gibi ayarlayın: kare monofazik nabız, gecikme 2 ms, uyaran darbe süresi 0.4 ms, uyaran yoğunluğu 2 V.
- İzometrik tetanik kuvvet ölçümü
- İdeal kas uzunluğunu belirledikten sonra, tetanik kas kasılmalarına başlamadan önce kası 5 dakika boyunca sıfır ön yükte dinlendirin.
- Bu arada, VI'da Parametre testinden Frekans testine geçin ve bipolar uyarıcı cihazında uyaran yoğunluğunu 10 V'a ayarlayın.
- Gecikme ve uyaran darbe süresini sırasıyla 2 ms ve 0,4 ms'de tutun.
- Maksimum kuvvet platosu gözlemlenene kadar 30 Hz'den başlayan artan uyaran frekanslarını kullanarak izometrik tetanik kas kuvvetini 30 Hz'lik artışlarla ölçün.
- Tetikleyici koleksiyonuna tıklayın ve önceden belirlenmiş en uygun kas uzunluğuna ayarlayın.
- Tetanik bir stimülasyonu en fazla 5 saniye boyunca veya bir kuvvet zirvesi açıkça gözlemlenene kadar teşvik etmek için bipolar stimülatör cihazındaki Tekrarla düğmesine basın.
NOT: Siniri uyarmadan önce, sinyalin çevredeki dokuya iletilmediğinden emin olmak için pamuk uçlu aplikatörler kullanarak siniri çevreleyen fazla % 0,9 NaCl'yi her zaman çıkarın. - Verileri toplamak için Tetikleyici koleksiyonu'na yeniden basın ve maksimum çıkış kuvvetini belgeleyin. Programın en yüksek maksimum çıkış kuvvetini otomatik olarak algılamaması durumunda, Reddet'e basın ve tepe noktasını manuel olarak seçin.
- Bir sonraki tetanik kas kasılmalarına başlamadan önce kası 5 dakika boyunca sıfır ön yükte tekrar dinlendirin.
NOT: Düzenli olarak (yaklaşık her 5 dakikada bir), soğutma ve desiccation önlemek için ısıtmalı% 0.9 NaCl (37 °C) ile TA kas nemli. - Maksimum kuvvet platosa ulaşılana kadar uyaran frekansını artırmaya devam edin. Kuvvet platosu maksimum izometrik tetanik kuvvet olarak tanımlanacaktır.
NOT: Bu adımdan sonra, K-tellerini çıkarın, cildi zımbalayın veya dikin ve tüm prosedürü 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ITF ölçümünü ölçmek için beş parametre kullanılır. Bunlar arasında kas gerginliği (ön yük kuvveti), uyaran yoğunluğu (voltaj), uyaran darbe frekansı, 0,4 ms uyaran süresi ve 2 ms gecikme saydır. ITF'yi ölçmeden önce, parametre testi sırasında 2 V şiddette iki tek seğirme kas kasılması kullanılarak en uygun kas gerginliği belirlenmek zorundadır. Bu uyaranlar pençenin dorsiflexion neden ve VI grafik üzerinde bir çıkış sinyali üretmek (Şekil 5). Bu tek seğirme eğrileri ideal olarak, doğrudan daralma dönemini temsil eden hızlı bir dikey yükselişe ve ardından gevşeme dönemini gösteren daha yavaş bir dikey düşüş dönemine sahiptir. Program bu iki tepe çıkış kuvvetinin ortalamasını alacaktır, ancak aktif kuvvetin, ortalama çıkış kuvvetinden ön yük kuvveti çıkarılarak manuel olarak hesaplanmaları gerekir. Şekil 5'tekiörnekte, 10 g'lık bir ön yük, ortalama 395,43 g (3,88 N) pik çıkış kuvvetine ortalama olarak verilen 411,09 g (4,03 N) ve 379,78 g (3,73 N) iki tepe çıkış kuvveti ile sonuçlanır. Her ön yükün etkin kuvvetleri bir grafikte çizildiğinde, maksimum aktif kuvvet tanımlanabilir. Bu aktif kuvvetler genellikle çan şeklinde bir eğri üretir ve 300-500 g ağırlığındaki Lewis sıçanları için maksimum aktif kuvvet 30-40 g (0.29-0.39 N) civarında olmalıdır (Şekil 6).
Frekans testi sırasında tetanik stimülasyonlar için, uyaran yoğunluğu, artan frekanslar kullanılarak tüm TA kas motor ünitelerinin maksimum aktivasyonunu sağlamak için supra-maksimal voltaja (10 V) yükseltilir. Optimal tetanik eğri keskin bir şekilde artar ve azalır ve minimum salınımlarla yavaş yavaş azalan bir plato aşamasına sahiptir. Şekil 7, 803,25 g (7,88 N) izometrik tetanik kuvvete sahip 30 Hz uyaran frekansı cinsinden tetanik eğrinin bir örneğini göstermektedir. En yüksek kuvvet platosu maksimum ITF olarak tanımlanır.
Şekil 1: Cerrahi bir hemostattan üretilen ve gerginliğin ayarını sağlayan bir sıkma vidası ile modifiye edilmiş özelleştirilmiş kelepçe görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: LabVIEW'de izometrik tetanik kuvvet ölçümü için sanal enstrüman için grafik kodu. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kuvvet dönüştürücünün kalibrasyonu. Kuvvet dönüştürücüslerinin beş ağırlıkla (0, 10, 20, 30 ve 50 g) başarılı kalibrasyonu pozitif doğrusal eğriye neden olmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İzometrik tetanik kuvvet ölçümü için deneysel kuruluma şematik genel bakış. (Telif hakkı ve Mayo Tıp Eğitimi ve Araştırma Vakfı'nın izniyle kullanılır; tüm hakları saklıdır. Yeniden basılan: Shin, R. H. ve ark. Sıçandaki tibialis ön kısmının izometrik tetanik kuvvet ölçüm yöntemi. Mikrocerrahi. 28 (6), 452-457 (2008)). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kas uzunluğunun optimizasyonu için temsili tek seğirme eğrileri. Her ön yük ölçümü için iki adet tek seğirme uygulanır. Bu tek seğirme eğrileri hızlı bir dikey yükselişe (daralma periyodu) ve ardından dikey bir düşüşe (gevşeme periyodu) sahiptir. İki tepe çıkış kuvveti ortalama bir tepe çıkış kuvvetine göre ortalama olarak elde edilecektir. Bir Lewis sıçanı ile bu örnekte, 10 g'lık bir ön yük, ortalama 395,43 g (3,88 N) pik çıkış kuvvetine ortalama olarak verilen 411,09 g (4,03 N) ve 379,78 g (3,73 N) iki tepe çıkış kuvvetiyle sonuçlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Optimal kas uzunluğu (ön yük). Aktif kas kuvveti, ortalama tepe çıkış kuvvetinden ön yükün çıkarılmasıyla hesaplanabilir. Her ön yük için aktif kas kuvveti, aktif kas kuvvetinde bir düşüş görünene kadar belgelenmelidir. en yüksek aktif kas kuvvetini sağlayan ön yük, izometrik tetanik kuvveti ölçmek için kullanılacaktır. 300-500 g ağırlığındaki Lewis sıçanları için en uygun ön yük yaklaşık 30-40 g (0.29-0.39 N) (N=10) olmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Temsili izometrik tetanik kuvvet eğrisi. Optimal tetanik eğri keskin bir şekilde artar, daha sonra yavaşça azalan bir plato fazı ve ardından keskin bir azalma vardır. En yüksek kuvvet platosu maksimum ITF olarak tanımlanır. Bu örnek, tetanik eğriyi 803,25 g (7,88 N) izometrik tetanik kuvvetle 30 Hz uyaran frekansı cinsinden göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, sıçan modelinde TA kasının doğru maksimum ITF ölçümlerini elde etmek için daha önce doğrulanmış bir yöntemi açıklar32. Deneysel sinir rekonstrüksiyon tedavilerinden sonra maksimum gücün geri kazanılması, sinirin sadece yenilenmediğini, aynı zamanda hedef kas ile çalışma bağlantıları yaptığını kanıtladığı için klinik ortamda birincil ilgi alanıdır. ITF, sıçan siyatik sinir modeli32gibi küçük bir sinir boşluğu modelinde kullanılabilir ve protokolde birkaç değişiklikle, daha büyük bir sinir boşluğu tavşan modelinde de kullanılabilir33.
Tutarlı ve güvenilir maksimum izometrik kas kuvveti ölçümleri sağlamak için dikkate alınması gereken birkaç kritik adım vardır. İskelet kas yan etkilerini önlemek için anestezi tipinin dikkatlice seçilmesinin önemi daha önce tanımlanmıştır32,33. Izofluran kullanımı, kas kuvvetinde zamana bağlı bir azalma göstermiştir, bu da sarkoplazmik retikulum uyarılmış kalsiyum salınımını teşvik etme yeteneği ile açıklanabilir33,48. Ketamin / ksilazinin kas kuvveti üzerindeki etkisinin, deneyimlerimize ve önceki çalışmaya dayanarak minimum olduğu kanıtlanmıştır32. Distal TA kas tendonunun kuvvet dönüştürücüye güvenli bir şekilde bağlanması da doğru ölçümler için büyük önem taşımaktadır. Tendonun kayması veya yırtılması önlenmeli veya doğrudan düzeltilmelidir. Bu nedenle, cerrahi bir hemostattan özel yapım bir kelepçe oluşturuldu ve sıkma vidası ile değiştirildi. Diğer araştırma grupları tendon ve kelepçe arasındaki arayüzü mekanik olarak güçlendirmek için tendonu yaklaşık 30 dakika kurutma tekniğinitanımlamışlardır 49. Kasın dayanıklılığını korumak için, TA kasının ve tendonunun sıcak% 0.9 NaCl ile desiccation önlemek ve her tetanik stimülasyon arasında 5 dakikalık bir dinlenme süresi uygulamak önemlidir. Dinlenme süresi, patlayıcı kas kasılmaları için önemli olan ve acil enerji kaynağı olarak da bilinen fosfatjen sisteminin aktivitesini temel dayanır. Adenozin trifosfat (ATP) ve kreatin fosfat aktivitesinden oluşur ve 10 saniyeden daha az maksimum aktivite için enerji sağlar. Fosfajenlerin% 100'ünü doldurmak için yaklaşık 3-5 dakika gerektirir50.
Bu videoda açıklanan yöntemin sınırlamalarını biliyoruz. İşlemin hayatta kalmama doğası zamanla seri ölçümlere izin vermez. Ayrıca, ayrıntılı ve zaman alan bir test protokolüdür. 1 ila 2 saatlik test süresi boyunca, sinir ve kas, ITF'de potansiyel azalma ile kas yorgunluğuna neden olabilecek önemli sayıda stimülasyona uğrar. Bununla birlikte, bu, sıçan modelinde tavşan33'ekıyasla daha az belirgin olduğu kanıtlanmıştır.
Sonuç olarak, bu videoda açıklanan ITF ölçümü, motor iyileşmeyi ölçmek için deneysel periferik sinir çalışmalarında paha biçilmez bir araçtır. Elektrofizyoloji ve histomomorf gibi diğer sonuç önlemleri sunulduğunda sinir fonksiyonunun küresel bir değerlendirmesi sağlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ro1 NS 102360 Ödül Numarası altında Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve Ulusal Sağlık Enstitüleri İnme Enstitüsü tarafından desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA | G130203 | |
| 1 mm Kirshner wires | Pfizer Howmedica, Rutherford, NJ | N/A | |
| Adson Tissue Forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | MTK-6801226 | |
| Bipolar electrode cables | Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
| Bipolar stimulator device | Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
| Cotton-tip Applicators | Cardinal Health, Waukegan, IL, USA | C15055-006 | |
| Curved Mosquito forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | MTK-1201112 | |
| Force Transducer MDB-2.5 | Transducer Techniques, Temecula, CA | N/A | |
| Gauze Sponges 4x4 | Covidien, Mansfield, MA, USA | 2733 | |
| Ground cable | Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
| Isoflurane chamber | N/A | N/A | Custom-made |
| Ketamine | Ketalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ | 42023-115-10 | |
| LabView Software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Loop | N/A | N/A | Custom-made |
| Microsurgical curved forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | JFA-5B | |
| Microsurgical scissors | ASSI, Westbury, NY, USA | SAS-15R-8-18 | |
| Microsurgical straight forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | JF-3 | |
| Retractor | ASSI, Westbury, NY, USA | AG-124426 | |
| Scalpel Blade No. 15 | Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA | 371115 | |
| Slim Body Skin Stapler | Covidien, Mansfield, MA, USA | 8886803512 | |
| Subminiature electrode | Harvard Apparatus, Holliston, MA | N/A | |
| Surgical Nerve Stimulator | Checkpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA | 9094 | |
| Terrell Isoflurane | Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA | H961J19A | |
| Testing platform | N/A | N/A | Custom-made |
| Tetontomy Scissors | ASSI, Westbury, NY, USA | ASIM-187 | |
| Traceable Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S407992 | |
| USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) device | National Instruments, Austin, TX | 779026-01 | |
| Vacuum Base Holder | Noga Engineering & Technology Ltd., Shlomi, Isreal | N/A | Attached clamp is custom-made |
| Weight (10 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820010.4 | |
| Weight (20 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820020.4 | |
| Weight (50 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820050.4 | |
| Xylazine | Xylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada | 1XYL002 |
References
- Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The incidence of peripheral nerve injury in extremity trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87 (5), 381-385 (2008).
- Huckhagel, T., Nuchtern, J., Regelsberger, J., Lefering, R., TraumaRegister, D. G. U. Nerve injury in severe trauma with upper extremity involvement: evaluation of 49,382 patients from the TraumaRegister DGU(R) between 2002 and 2015. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 26 (1), 76 (2018).
- Tapp, M., Wenzinger, E., Tarabishy, S., Ricci, J., Herrera, F. A. The Epidemiology of Upper Extremity Nerve Injuries and Associated Cost in the US Emergency Departments. Annals of Plastic Surgery. 83 (6), 676-680 (2019).
- Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: a review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 698256 (2014).
- Terzis, J., Faibisoff, B., Williams, B. The nerve gap: suture under tension vs. graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 56 (2), 166-170 (1975).
- Millesi, H. Forty-two years of peripheral nerve surgery. Microsurgery. 14 (4), 228-233 (1993).
- Wood, M. D., Kemp, S. W., Weber, C., Borschel, G. H., Gordon, T. Outcome measures of peripheral nerve regeneration. Annals of Anatomy-Anatomischer Anzeiger. 193 (4), 321-333 (2011).
- Alvites, R., et al. Peripheral nerve injury and axonotmesis: State of the art and recent advances. Cogent Medicine. 5 (1), 1466404 (2018).
- Diogo, C. C., et al. The use of sheep as a model for studying peripheral nerve regeneration following nerve injury: review of the literature. Journal of Neurology Research. 39 (10), 926-939 (2017).
- Irintchev, A. Potentials and limitations of peripheral nerve injury models in rodents with particular reference to the femoral nerve. Annals of Anatomy. 193 (4), 276-285 (2011).
- Brenner, M. J., et al. Role of timing in assessment of nerve regeneration. Microsurgery. 28 (4), 265-272 (2008).
- Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: a systematic review. Laboratory investigation. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
- Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 1162, 179-188 (2014).
- Dellon, A. L., Mackinnon, S. E. Selection of the appropriate parameter to measure neural regeneration. Annals of Plastic Surgery. 23 (3), 197-202 (1989).
- Munro, C. A., Szalai, J. P., Mackinnon, S. E., Midha, R. Lack of association between outcome measures of nerve regeneration. Muscle Nerve. 21 (8), 1095-1097 (1998).
- Varejao, A. S., Melo-Pinto, P., Meek, M. F., Filipe, V. M., Bulas-Cruz, J. Methods for the experimental functional assessment of rat sciatic nerve regeneration. Journal of Neurology Research. 26 (2), 186-194 (2004).
- Hadlock, T. A., Koka, R., Vacanti, J. P., Cheney, M. L. A comparison of assessments of functional recovery in the rat. Journal of the Peripheral Nervous System. 4 (3-4), 258-264 (1999).
- Kanaya, F., Firrell, J. C., Breidenbach, W. C. Sciatic function index, nerve conduction tests, muscle contraction, and axon morphometry as indicators of regeneration. Plastic and Reconstructive Surgery. 98 (7), 1264-1271 (1996).
- Nichols, C. M., et al. Choosing the correct functional assay: a comprehensive assessment of functional tests in the rat. Behavioural Brain Research. 163 (2), 143-158 (2005).
- Terzis, J. K., Smith, K. J. Repair of severed peripheral nerves: comparison of the "de Medinaceli" and standard microsuture methods. Experimental Neurology. 96 (3), 672-680 (1987).
- de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
- Doi, K., Hattori, Y., Tan, S. H., Dhawan, V. Basic science behind functioning free muscle transplantation. Clinics in Plastic Surgery. 29 (4), (2002).
- Vathana, T., et al. An Anatomic study of the spinal accessory nerve: Extended harvest permits direct nerve transfer to distal plexus targets. Clinical Anatomy. 20 (8), 899-904 (2007).
- Chaiyasate, K., Schaffner, A., Jackson, I. T., Mittal, V. Comparing FK-506 with basic fibroblast growth factor (b-FGF) on the repair of a peripheral nerve defect using an autogenous vein bridge model. Journal of Investigative Surgery. 22 (6), 401-405 (2009).
- Lee, B. K., Kim, C. J., Shin, M. S., Cho, Y. S. Diosgenin improves functional recovery from sciatic crushed nerve injury in rats. Journal of Exercise Rehabilitation. 14 (4), 566-572 (2018).
- Lubiatowski, P., Unsal, F. M., Nair, D., Ozer, K., Siemionow, M. The epineural sleeve technique for nerve graft reconstruction enhances nerve recovery. Microsurgery. 28 (3), 160-167 (2008).
- Luis, A. L., et al. Use of PLGA 90:10 scaffolds enriched with in vitro-differentiated neural cells for repairing rat sciatic nerve defects. Tissue Engineering, Part A. 14 (6), 979-993 (2008).
- Shabeeb, D., et al. Histopathological and Functional Evaluation of Radiation-Induced Sciatic Nerve Damage: Melatonin as Radioprotector. Medicina. 55 (8), Kaunas. (2019).
- Bain, J. R., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Functional evaluation of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 83 (1), 129-138 (1989).
- Monte-Raso, V. V., Barbieri, C. H., Mazzer, N., Yamasita, A. C., Barbieri, G. Is the Sciatic Functional Index always reliable and reproducible. Journal of Neuroscience Methods. 170 (2), 255-261 (2008).
- Lee, J. Y., et al. Functional evaluation in the rat sciatic nerve defect model: a comparison of the sciatic functional index, ankle angles, and isometric tetanic force. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (5), 1173-1180 (2013).
- Shin, R. H., et al. Isometric tetanic force measurement method of the tibialis anterior in the rat. Microsurgery. 28 (6), 452-457 (2008).
- Giusti, G., et al. Description and validation of isometric tetanic muscle force test in rabbits. Microsurgery. 32 (1), 35-42 (2012).
- Bulstra, L. F., et al. Functional Outcome after Reconstruction of a Long Nerve Gap in Rabbits Using Optimized Decellularized Nerve Allografts. Plastic and Reconstructive Surgery. 145 (6), 1442-1450 (2020).
- Giusti, G., et al. The influence of vascularization of transplanted processed allograft nerve on return of motor function in rats. Microsurgery. 36 (2), 134-143 (2016).
- Giusti, G., et al. The influence of nerve conduits diameter in motor nerve recovery after segmental nerve repair. Microsurgery. 34 (8), 646-652 (2014).
- Hundepool, C. A., et al. Comparable functional motor outcomes after repair of peripheral nerve injury with an elastase-processed allograft in a rat sciatic nerve model. Microsurgery. 38 (7), 772-779 (2018).
- Lee, J. Y., et al. The effect of collagen nerve conduits filled with collagen-glycosaminoglycan matrix on peripheral motor nerve regeneration in a rat model. Journal of Bone and Joint Surgery. 94 (22), 2084-2091 (2012).
- Shin, R. H., Friedrich, P. F., Crum, B. A., Bishop, A. T., Shin, A. Y. Treatment of a segmental nerve defect in the rat with use of bioabsorbable synthetic nerve conduits: a comparison of commercially available conduits. Journal of Bone and Joint Surgery. 91 (9), 2194-2204 (2009).
- Coombes, J. S., et al. Effects of vitamin E deficiency on fatigue and muscle contractile properties. Eur J Appl Physiol. 87 (3), 272-277 (2002).
- Kauvar, D. S., Baer, D. G., Dubick, M. A., Walters, T. J. Effect of fluid resuscitation on acute skeletal muscle ischemia-reperfusion injury after hemorrhagic shock in rats. Journal of the American College of Surgeons. 202 (6), 888-896 (2006).
- Murlasits, Z., et al. Resistance training increases heat shock protein levels in skeletal muscle of young and old rats. Experimental Gerontology. 41 (4), 398-406 (2006).
- Zhou, Z., Cornelius, C. P., Eichner, M., Bornemann, A. Reinnervation-induced alterations in rat skeletal muscle. Neurobiology of Disease. 23 (3), 595-602 (2006).
- Schmoll, M., et al. In-situ measurements of tensile forces in the tibialis anterior tendon of the rat in concentric, isometric, and resisted co-contractions. Physiological Reports. 5 (8), (2017).
- Heinzel, J. C., Hercher, D., Redl, H. The course of recovery of locomotor function over a 10-week observation period in a rat model of femoral nerve resection and autograft repair. Brain and Behavior. 10 (4), 01580 (2020).
- Kingery, W. S., Vallin, J. A. The development of chronic mechanical hyperalgesia, autotomy and collateral sprouting following sciatic nerve section in rat. Pain. 38 (3), 321-332 (1989).
- Weber, R. A., Proctor, W. H., Warner, M. R., Verheyden, C. N. Autotomy and the sciatic functional index. Microsurgery. 14 (5), 323-327 (1993).
- Kunst, G., Graf, B. M., Schreiner, R., Martin, E., Fink, R. H. Differential effects of sevoflurane, isoflurane, and halothane on Ca2+ release from the sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. Anesthesiology. 91 (1), 179-186 (1999).
- Schmoll, M., et al. A novel miniature in-line load-cell to measure in-situ tensile forces in the tibialis anterior tendon of rats. PLoS One. 12 (9), 0185209 (2017).
- Paul, R. J. Cell Physiology Source Book (Fourth Edition). Sperelakis, N. , Academic Press. 801-821 (2012).
