Mikrodissektion des Mausgehirns in funktionell und anatomisch unterschiedliche Regionen
Summary
Wir präsentieren ein praktisches, schrittweises, schnelles Protokoll für die Entfernung und Dissektion diskreter Regionen aus frischem Hirngewebe von Mäusen. Die Gewinnung von Hirnregionen für molekulare Analysen ist in vielen neurowissenschaftlichen Laboren zur Routine geworden. Diese Gehirnregionen werden sofort eingefroren, um qualitativ hochwertige transkriptomische Daten für die Analyse auf Systemebene zu erhalten.
Abstract
Das Gehirn ist die Kommandozentrale für das Nervensystem von Säugetieren und ein Organ mit enormer struktureller Komplexität. Geschützt im Schädel besteht das Gehirn aus einer äußeren Hülle aus grauer Substanz über den Hemisphären, die als Großhirnrinde bekannt ist. Unter dieser Schicht befinden sich viele andere spezialisierte Strukturen, die für mehrere Phänomene unerlässlich sind, die für die Existenz wichtig sind. Die Entnahme von Proben bestimmter grober Hirnregionen erfordert schnelle und präzise Sezierschritte. Es versteht sich, dass auf mikroskopischer Ebene viele Teilregionen existieren und wahrscheinlich die willkürlichen regionalen Grenzen überschreiten, die wir für diese Analyse auferlegen.
Mausmodelle werden routinemäßig verwendet, um menschliche Gehirnfunktionen und Krankheiten zu untersuchen. Veränderungen in den Genexpressionsmustern können auf bestimmte Gehirnbereiche beschränkt sein, die auf einen bestimmten Phänotyp abzielen, abhängig vom erkrankten Zustand. Daher ist es von großer Bedeutung, die Regulation der Transkription in Bezug auf ihre genau definierte strukturelle Organisation zu untersuchen. Ein vollständiges Verständnis des Gehirns erfordert die Untersuchung verschiedener Gehirnregionen, die Definition von Verbindungen und die Identifizierung wichtiger Unterschiede in den Aktivitäten jeder dieser Gehirnregionen. Ein umfassenderes Verständnis jeder dieser verschiedenen Regionen könnte den Weg für neue und verbesserte Behandlungen auf dem Gebiet der Neurowissenschaften ebnen. Hier diskutieren wir eine Schritt-für-Schritt-Methodik zur Zerlegung des Mausgehirns in sechzehn verschiedene Regionen. In diesem Verfahren haben wir uns auf die Entfernung und Dissektion des Gehirns der männlichen Maus C57Bl / 6J (6-8 Wochen alt) unter Verwendung neuroanatomischer Orientierungspunkte konzentriert, um diskrete funktionell relevante und verhaltensrelevante Gehirnregionen zu identifizieren und zu beproben. Diese Arbeit wird dazu beitragen, eine starke Grundlage auf dem Gebiet der Neurowissenschaften zu schaffen, was zu fokussierteren Ansätzen im tieferen Verständnis der Gehirnfunktion führt.
Introduction
Das Gehirn bildet zusammen mit dem Rückenmark und der Netzhaut das zentrale Nervensystem, das komplexe Verhaltensweisen ausführt, die von spezialisierten, präzise positionierten und interagierenden Zelltypen im gesamten Körper gesteuert werden1. Das Gehirn ist ein komplexes Organ mit Milliarden von miteinander verbundenen Neuronen und Gliazellen mit präzisen Schaltkreisen, die zahlreiche Funktionen erfüllen. Es ist eine bilaterale Struktur mit zwei verschiedenen Lappen und verschiedenen zellulären Komponenten2. Das Rückenmark verbindet das Gehirn mit der Außenwelt und wird durch Knochen, Hirnhäute und Liquor geschützt und leitet Nachrichten zum und vom Gehirn 2,3,4. Die Oberfläche des Gehirns, die Großhirnrinde, ist uneben und hat deutliche Falten, genannt Gyri, und Rillen, genannt Sulci, die das Gehirn in funktionelle Zentren trennen5. Der Kortex ist bei Säugetieren glatt mit einem kleinen Gehirn 6,7. Es ist wichtig, die Architektur des menschlichen Gehirns zu charakterisieren und zu untersuchen, um die Störungen im Zusammenhang mit den verschiedenen Gehirnregionen sowie seine funktionellen Schaltkreise zu verstehen. Die neurowissenschaftliche Forschung hat sich in den letzten Jahren erweitert und eine Vielzahl von experimentellen Methoden wird verwendet, um die Struktur und Funktion des Gehirns zu untersuchen. Entwicklungen auf dem Gebiet der molekularen und systemischen Biologie haben eine neue Ära der Erforschung der komplexen Beziehung zwischen Gehirnstrukturen und der Funktionsweise von Molekülen eingeleitet. Darüber hinaus expandieren Molekularbiologie, Genetik und Epigenetik rasant, was es uns ermöglicht, unser Wissen über die zugrunde liegenden Mechanismen zu erweitern, die an der Funktionsweise von Systemen beteiligt sind. Diese Analysen können auf einer viel lokaleren Basis durchgeführt werden, um die Erforschung und Entwicklung wirksamerer Therapien gezielt zu unterstützen.
Das Gehirn von Säugetieren ist strukturell in klar identifizierbare diskrete Regionen unterteilt; Die funktionelle und molekulare Komplexität dieser diskreten Strukturen ist jedoch noch nicht klar verstanden. Die multidimensionale und vielschichtige Natur des Hirngewebes macht es schwierig, diese Landschaft auf funktioneller Ebene zu untersuchen. Darüber hinaus erschwert die Tatsache, dass mehrere Funktionen von derselben Struktur ausgeführt werden und umgekehrt, das Verständnis des Gehirns weiter8. Es ist wichtig, dass der experimentelle Ansatz zur strukturellen und funktionellen Charakterisierung von Hirnregionen präzise Forschungsmethoden verwendet, um eine Konsistenz bei der Stichprobe für die Korrelation der neuroanatomischen Architektur mit der Funktion zu erreichen. Die Komplexität des Gehirns wurde kürzlich mit Hilfe der Einzelzellsequenzierung 9,10 erklärt, wie z.B. dem Gyrus temporalis des menschlichen Gehirns, das aus 75 verschiedenen Zelltypen besteht 11. Durch den Vergleich dieser Daten mit denen aus einer analogen Region des Mausgehirns zeigt die Studie nicht nur Ähnlichkeiten in ihrer Architektur und Zelltypen, sondern zeigt auch die Unterschiede auf. Um die komplexen Mechanismen zu entschlüsseln, ist es daher wichtig, verschiedene Regionen des Gehirns mit voller Präzision zu untersuchen. Konservierte Strukturen und Funktionen zwischen einem menschlichen und einem Mausgehirn ermöglichen die Verwendung einer Maus als vorläufiges Surrogat zur Aufklärung der menschlichen Gehirnfunktion und der Verhaltensergebnisse.
Mit der Weiterentwicklung systembiologischer Ansätze ist die Gewinnung von Informationen aus diskreten Hirnregionen bei Nagetieren zu einem Schlüsselverfahren in der neurowissenschaftlichen Forschung geworden. Während einige Protokolle wie die Lasererfassungsmikrodissektion12 teuer sein können, sind mechanische Protokolle kostengünstig und werden mit allgemein verfügbaren Werkzeugendurchgeführt 13,14. Wir haben mehrere Gehirnregionen für transkriptomische Assays15 verwendet und ein praktisches und schnelles Verfahren entwickelt, um Maushirnregionen von Interesse Schritt für Schritt in kurzer Zeit zu sezieren. Nach dem Sezieren können diese Proben sofort unter kalten Bedingungen gelagert werden, um die Nukleinsäuren und Proteine dieser Gewebe zu erhalten. Unser Ansatz kann schneller durchgeführt werden, was zu einer hohen Effizienz führt und weniger Chancen für eine Gewebeverschlechterung zulässt. Dies erhöht letztendlich die Chancen, qualitativ hochwertige, reproduzierbare Experimente mit Hirngewebe zu generieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Gehirn von Säugetieren ist ein komplexes Organ, das aus einer Reihe morphologisch unterschiedlicher und funktionell einzigartiger Zellen mit verschiedenen molekularen Signaturen und mehreren Regionen besteht, die spezialisierte und diskrete Funktionen erfüllen. Das hier beschriebene Präparierverfahren kann je nach den Anforderungen des Labors mehrere Ziele haben. In unserem Labor untersuchten wir die Transkription in mehreren Gehirnregionen, die von Mäusen gesammelt wurden, die PTBS wie Stress ausgesetzt waren<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Frau Seshmalini Srinivasan, Herrn Stephen Butler und Frau Pamela Spellman für die experimentelle Unterstützung und Frau Dana Youssef für die Bearbeitung des Manuskripts. Die finanzielle Unterstützung von USAMRDC wird dankbar gewürdigt. Die Genfer Stiftung trug zu dieser Arbeit bei und wurde durch Mittel des Military and Operational Medicine Research Area Directorate III über das US Army Research Office unterstützt.
Verzichtserklärung:
Das Material wurde vom Walter Reed Army Institute of Research überprüft. Gegen die Darstellung und/oder Veröffentlichung ist nichts einzuwenden. Die hierin enthaltenen Meinungen oder Behauptungen sind die privaten Ansichten des Autors und dürfen nicht als offiziell ausgelegt werden oder spiegeln wahre Ansichten des Department of the Army oder des Department of Defense wider. Die Forschung wurde unter einem genehmigten Tierverwendungsprotokoll in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz und anderen Bundesgesetzen und -vorschriften in Bezug auf Tiere und Tierversuche durchgeführt und entspricht den Grundsätzen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren, NRC Publication, Ausgabe 2011.
Materials
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
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