Microdissezione del cervello di topo in regioni funzionalmente e anatomicamente diverse
Summary
Presentiamo un protocollo pratico, passo-passo, rapido per la rimozione del cervello del topo e la dissezione di regioni discrete dal tessuto cerebrale fresco. Ottenere regioni cerebrali per l’analisi molecolare è diventato routine in molti laboratori di neuroscienze. Queste regioni cerebrali vengono immediatamente congelate per ottenere dati trascrittomici di alta qualità per l’analisi a livello di sistema.
Abstract
Il cervello è il centro di comando per il sistema nervoso dei mammiferi e un organo con un’enorme complessità strutturale. Protetto all’interno del cranio, il cervello è costituito da un rivestimento esterno di materia grigia sopra gli emisferi noto come corteccia cerebrale. Sotto questo strato risiedono molte altre strutture specializzate che sono essenziali per molteplici fenomeni importanti per l’esistenza. L’acquisizione di campioni di specifiche regioni cerebrali lorde richiede passaggi di dissezione rapidi e precisi. Resta inteso che a livello microscopico, esistono molte sottoregioni e probabilmente attraversano i confini regionali arbitrari che imponiamo ai fini di questa dissezione.
I modelli murini sono abitualmente utilizzati per studiare le funzioni e le malattie del cervello umano. I cambiamenti nei modelli di espressione genica possono essere limitati a specifiche aree cerebrali mirate a un particolare fenotipo a seconda dello stato patologico. Pertanto, è di grande importanza studiare la regolazione della trascrizione rispetto alla sua organizzazione strutturale ben definita. Una comprensione completa del cervello richiede lo studio di regioni cerebrali distinte, la definizione di connessioni e l’identificazione delle differenze chiave nelle attività di ciascuna di queste regioni cerebrali. Una comprensione più completa di ciascuna di queste regioni distinte può aprire la strada a trattamenti nuovi e migliori nel campo delle neuroscienze. Qui, discutiamo una metodologia passo-passo per sezionare il cervello del topo in sedici regioni distinte. In questa procedura, ci siamo concentrati sulla rimozione cerebrale del topo maschio C57Bl / 6J (6-8 settimane) e sulla dissezione in più regioni utilizzando punti di riferimento neuroanatomici per identificare e campionare regioni cerebrali discrete funzionalmente rilevanti e comportamentali. Questo lavoro contribuirà a gettare solide basi nel campo delle neuroscienze, portando ad approcci più mirati nella comprensione più profonda della funzione cerebrale.
Introduction
Il cervello, insieme al midollo spinale e alla retina, comprende il sistema nervoso centrale che esegue comportamenti complessi, controllati da tipi di cellule specializzate, posizionate con precisione e interagenti in tutto il corpo1. Il cervello è un organo complesso con miliardi di neuroni interconnessi e glia con circuiti precisi che svolgono numerose funzioni. È una struttura bilaterale con due lobi distinti e diversi componenti cellulari2. Il midollo spinale collega il cervello al mondo esterno ed è protetto da ossa, meningi e liquido cerebrospinale e indirizza i messaggi da e verso il cervello 2,3,4. La superficie del cervello, la corteccia cerebrale, è irregolare e presenta pieghe distinte, chiamate gyri, e solchi, chiamati solchi, che separano il cervello in centri funzionali5. La corteccia è liscia nei mammiferi con un piccolo cervello 6,7. È importante caratterizzare e studiare l’architettura del cervello umano al fine di comprendere i disturbi legati alle diverse regioni del cervello, nonché i suoi circuiti funzionali. La ricerca neuroscientifica si è espansa negli ultimi anni e una varietà di metodi sperimentali vengono utilizzati per studiare la struttura e la funzione del cervello. Gli sviluppi nel campo della biologia molecolare e a livello di sistema hanno inaugurato una nuova era di esplorazione della complessa relazione tra le strutture cerebrali e il funzionamento delle molecole. Inoltre, la biologia molecolare, la genetica e l’epigenetica si stanno rapidamente espandendo, permettendoci di far progredire la nostra conoscenza dei meccanismi sottostanti coinvolti nel funzionamento dei sistemi. Queste analisi possono essere effettuate su una base molto più localizzata, per aiutare a indirizzare la ricerca e lo sviluppo di terapie più efficaci.
Il cervello dei mammiferi è strutturalmente definito in regioni discrete chiaramente identificabili; Tuttavia, le complessità funzionali e molecolari di queste strutture discrete non sono ancora chiaramente comprese. La natura multidimensionale e multistrato del tessuto cerebrale rende questo paesaggio difficile da studiare a livello funzionale. Inoltre, il fatto che più funzioni siano eseguite dalla stessa struttura e viceversa complica ulteriormente la comprensione del cervello8. È fondamentale che l’approccio sperimentale eseguito per la caratterizzazione strutturale e funzionale delle regioni cerebrali utilizzi precise metodologie di ricerca per ottenere coerenza nel campionamento per correlare l’architettura neuroanatomica con la funzione. La complessità del cervello è stata recentemente spiegata utilizzando il sequenziamento a singola cellula 9,10 come il giro temporale del cervello umano che è composto da 75 tipi di cellule distinte 11. Confrontando questi dati con quelli provenienti da una regione analoga del cervello del topo, lo studio non solo rivela somiglianze nella loro architettura e nei tipi di cellule, ma presenta anche le differenze. Per svelare i complessi meccanismi, è quindi importante studiare diverse regioni del cervello con la massima precisione. Le strutture e le funzioni conservate tra un cervello umano e quello di topo consentono l’uso di un topo come surrogato preliminare per chiarire la funzione cerebrale umana e i risultati comportamentali.
Con il progresso degli approcci di biologia dei sistemi, ottenere informazioni da regioni cerebrali discrete nei roditori è diventata una procedura chiave nella ricerca neuroscientifica. Mentre alcuni protocolli come la microdissezione a cattura laser12 possono essere costosi, i protocolli meccanici sono economici ed eseguiti utilizzando strumenti comunemente disponibili13,14. Abbiamo utilizzato più regioni cerebrali per i saggi trascrittomici15 e abbiamo sviluppato una procedura pratica e rapida per sezionare le regioni cerebrali di topo di interesse in modo passo-passo in breve tempo. Una volta sezionati, questi campioni possono essere conservati immediatamente in condizioni fredde per preservare gli acidi nucleici e le proteine di questi tessuti. Il nostro approccio può essere eseguito più velocemente portando ad un’elevata efficienza e consentendo meno possibilità di deterioramento dei tessuti. Questo in definitiva, aumenta le possibilità di generare esperimenti di alta qualità e riproducibili utilizzando tessuti cerebrali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il cervello dei mammiferi è un organo complesso composto da una serie di cellule morfologicamente distinte e funzionalmente uniche con diverse firme molecolari e regioni multiple che svolgono funzioni specializzate e discrete. La procedura di dissezione qui riportata può avere più obiettivi a seconda delle esigenze del laboratorio. Nel nostro laboratorio abbiamo valutato la trascrizione in più regioni del cervello raccolte da topi esposti a PTSD come lo stress16 . Vorremmo studiare ulteriormen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la signora Seshmalini Srinivasan, il signor Stephen Butler e la signora Pamela Spellman per l’assistenza sperimentale e la signora Dana Youssef per la revisione del manoscritto. Il sostegno finanziario da parte di USAMRDC è riconosciuto con gratitudine. La Fondazione di Ginevra ha contribuito a questo lavoro ed è stata sostenuta da fondi della Direzione III dell’Area di Ricerca di Medicina Militare e Operativa tramite l’Ufficio di Ricerca dell’Esercito degli Stati Uniti.
Disconoscimento:
Il materiale è stato esaminato dal Walter Reed Army Institute of Research. Non vi sono obiezioni alla sua presentazione e/o pubblicazione. Le opinioni o le affermazioni contenute nel presente documento sono opinioni private dell’autore e non devono essere interpretate come ufficiali o come riflettenti le vere opinioni del Dipartimento dell’Esercito o del Dipartimento della Difesa. La ricerca è stata condotta nell’ambito di un protocollo approvato per l’uso degli animali in una struttura accreditata AAALAC in conformità con l’Animal Welfare Act e altri statuti e regolamenti federali relativi agli animali e agli esperimenti che coinvolgono animali e aderisce ai principi indicati nella Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio, pubblicazione NRC, edizione 2011.
Materials
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
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