Plantmonstervoorbereiding voor nucleoside/nucleotide-inhoudsmeting met een HPLC-MS/MS
Summary
Een nauwkeurige en reproduceerbare methode voor in vivo nucleosiden/nucleotiden kwantificering in planten wordt hier beschreven. Deze methode maakt gebruik van een HPLC-MS/MS.
Abstract
Nucleosiden/nucleotiden zijn bouwstenen van nucleïnezuren, delen van cosubstraten en co-enzymen, celsignaleringsmoleculen en energiedragers, die betrokken zijn bij veel celactiviteiten. Hier beschrijven we een snelle en betrouwbare methode voor de absolute kwalificatie van nucleoside/nucleotidegehalte in planten. Kortom, 100 mg gehomogeniseerd plantaardig materiaal werd geëxtraheerd met 1 ml extractiebuffer (methanol, acetonitril en water in een verhouding van 2:2:1). Later werd het monster vijf keer geconcentreerd in een vriesdroger en vervolgens geïnjecteerd in een HPLC-MS/MS. Nucleotiden werden gescheiden op een poreuze grafitische koolstofkolom (PGC) en nucleosiden werden gescheiden op een C18-kolom. De massaovergangen van elke nucleoside en nucleotide werden gecontroleerd door massaspectrometrie. De inhoud van de nucleosiden en nucleotiden werd gekwantificeerd aan de hand van hun externe normen (ESTD’s). Met deze methode kunnen onderzoekers daarom nucleosiden/nucleotiden in verschillende planten eenvoudig kwantificeren.
Introduction
Nucleosiden/Nucleotiden zijn centrale metabolische componenten in alle levende organismen, die de voorlopers zijn van nucleïnezuren en veel co-enzymen, zoals nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), en belangrijk bij de synthese van macromoleculen zoals fosfolipiden, glycolipiden en polysachariden. Structureel bevat nucleoside een nucleobase, die een adenine, guanine, uracil, cytosine of thymine kan zijn, en een suikeremoiety, die een ribose of een deoxyribose1,2kan zijn . Nucleotiden hebben maximaal drie fosfaatgroepen die zich binden aan de 5-koolstofpositie van de suikermoiety van de nucleosiden3. Het metabolisme van nucleotiden in planten is essentieel voor zaadkieming en bladgroei4,5,6. Om hun fysiologische rol in de ontwikkeling van planten beter te begrijpen, moeten de methoden voor de absolute kwantificering van verschillende nucleosiden/nucleotiden in vivo worden vastgesteld.
Een van de meest gebruikte benaderingen voor het meten van nucleosiden/nucleotiden maakt gebruik van een hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) in combinatie met een ultraviolet-zichtbare (UV-VIS) detector4,7,8,9,10,11. In 2013 kwantificeerden Dahncke en Witte met behulp van HPLC verschillende soorten nucleosiden in Arabidopsis thaliana7. Ze identificeerden een verhoogd guanosinegehalte in een T-DNA insertie mutant gericht op het guanosine deaminase gen in vergelijking met de wilde plant. Een andere pyrimidine nucleoside, cytidine, werd ook kwantitatief gedetecteerd in planten die deze methode gebruikten, wat resulteerde in de identificatie van een bonafide cytidine-deaminasegen4. Op basis van de UV-detector kan deze methode echter niet gemakkelijk de nucleosiden onderscheiden die vergelijkbare spectrums en retentietijden hebben, bijvoorbeeld guanosine of xanthosine. De detectielimiet van de HPLC-methode is relatief hoog en wordt daarom vaak gebruikt voor het meten van een hoog gehalte aan nucleosiden in vivo, zoals cytidine, uridine en guanosine.
Daarnaast kan gaschromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (GC-MS) ook worden gebruikt bij nucleosidemeting. Profiteer ervan, Hauck et. al. met succes uridine en urinezuur, een downstream metaboliet van nucleoside katabole route, in de zaden van A. thaliana12. GC wordt echter normaal gesproken gebruikt om vluchtige stoffen te scheiden, maar is niet geschikt voor de thermisch labiele stoffen. Daarom is een vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC-MS/MS) waarschijnlijk een meer geschikte en nauwkeurige analysetechniek voor de in vivo identificatie, scheiding en kwantificering van de nucleosiden/nucleotiden13,14. Verschillende eerdere studies meldden dat een HILIC-kolom kan worden gebruikt voor nucleosiden en nucleotidenscheiding15,16 en isotopisch gelabelde interne normen werden gebruikt voor de samengestelde kwantificering17. Beide componenten zijn echter relatief duur, vooral de commerciële normen met isotooplabel. Hier rapporteren we een economisch toepasbare LC-MS/MS-benadering voor nucleosiden/nucleotidenmeting. Deze methode is al met succes gebruikt voor de kwantificering van diverse nucleosiden/nucleotiden, waaronder ATP, N6-methyl-AMP, AMP, GMP, uridine, cytidine en pseudouridine1,5,6,18, in planten en Drosophila. Bovendien kan de methode die we hier rapporteren ook in andere organismen worden gebruikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organismen bevatten verschillende nucleosiden/nucleotiden, waaronder canonieke en afwijkende. De oorsprong en metabolische eindpunten ervan, vooral gemodificeerde nucleosiden, zijn echter nog steeds onduidelijk. Bovendien moet het huidige begrip van de functie en homeostase van het metabolisme van nucleosiden/nucleotiden nog worden onderzocht en uitgebreid. Om ze te onderzoeken, moet een nauwkeurige en gouden standaardmethode voor de identificatie en kwantificering van deze metabolieten worden gebruikt. Hier beschreven w…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd financieel ondersteund door de Fundamental Research Funds for the Central Universities (KJQN202060), de National Natural Science Foundation of China (31900907), de Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190528), het International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (CRP/CHN20-04_EC) tot M.C., en de Fundamental Research Funds for the Central Universities (LGZD202004).
Materials
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -. P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
- Witte, C. -. P., Herde, M. Nucleotide metabolism in plants. Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).
- Chen, M., Herde, M., Witte, C. -. P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
- Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
- Chen, M., Witte, C. -. P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
- Dahncke, K., Witte, C. -. P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
- Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
- Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
- Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
- Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
- Zong, S. -. Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
- Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
- Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
- Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
- Baccolini, C., Witte, C. -. P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).
