एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम स्ट्रेस्ड न्यूरॉन्स में लेंटीवायरस-डिलीवर विशिष्ट एसएचआरएनए द्वारा आणविक मॉड्यूलेशन
Summary
वर्तमान अध्ययन में, विशिष्ट एसएचआरएनए का उपयोग करके, पर्क मार्ग के दो डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग घटकों, साइटोप्रोटेक्टिव कैल्सिनयूरिन और प्रो-एपोप्टोटिक चॉप की अभिव्यक्ति को नीचे गिरा दिया गया है। विपरीत तरीकों से, ये एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम तनाव के प्रेरण के बाद न्यूराइट शोष के लिए प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स की संवेदनशीलता को नियंत्रित करते हैं।
Abstract
एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) के भीतर अनफोल्डेड प्रोटीन का संचय, किसी भी तनाव की स्थिति के कारण, विशेष सेंसर के सक्रियण के माध्यम से अनफोल्डेड प्रोटीन प्रतिक्रिया (यूपीआर) को ट्रिगर करता है। यूपीआर पहले होमियोस्टैसिस को बहाल करने का प्रयास करता है; लेकिन अगर क्षति बनी रहती है तो सिग्नलिंग एपोप्टोसिस को प्रेरित करता है।
इस बात के प्रमाण बढ़ रहे हैं कि निरंतर और अनसुलझे ईआर तनाव न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों सहित कई रोग स्थितियों में योगदान देता है। क्योंकि यूपीआर साइटोप्रोटेक्टिव और एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं के बीच स्विच करके सेल भाग्य को नियंत्रित करता है, इस संक्रमण को परिभाषित करने वाली घटनाओं के साथ-साथ इसके मॉड्यूलेशन में शामिल तत्वों को समझना आवश्यक है।
हाल ही में, हमने प्रदर्शित किया कि असामान्य जीएम 2 गैंग्लियाओसाइड संचय ईआर सीए2 + सामग्री की कमी का कारण बनता है, जो बदले में यूपीआर सेंसर में से एक पर्क (पीकेआर-जैसे-ईआर किनेज) को सक्रिय करता है। इसके अलावा, पर्क सिग्नलिंग जीएम 2 संचय द्वारा प्रेरित न्यूराइट शोष और एपोप्टोसिस में भाग लेता है। इस संबंध में, हमने एक प्रयोगात्मक प्रणाली स्थापित की है जो हमें डाउनस्ट्रीम पीईआरके घटकों की अभिव्यक्ति को आणविक रूप से संशोधित करने की अनुमति देती है और इस प्रकार न्यूरिटिक शोष से गुजरने के लिए न्यूरॉन्स की भेद्यता को बदल देती है।
हमने चूहे के कॉर्टिकल न्यूरोनल संस्कृतियों में कैल्सिनयूरिन (साइटोप्रोटेक्टिव) और सीएचओपी (प्रो-एपोप्टोटिक) अभिव्यक्ति का वध किया। कोशिकाओं को लेंटिवायरस-वितरित विशिष्ट एसएचआरएनए से संक्रमित किया गया था और फिर अलग-अलग समय पर जीएम 2 के साथ इलाज किया गया था, एंटी-एमएपी 2 (माइक्रोट्यूब से जुड़े प्रोटीन 2) एंटीबॉडी के साथ तय और इम्यूनोस्टेन किया गया था। बाद में, सेल छवियों को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके रिकॉर्ड किया गया था और सार्वजनिक डोमेन छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर इमेजजे का उपयोग करके कुल न्यूराइट आउटग्रोथ का मूल्यांकन किया गया था। उन पर्क सिग्नलिंग घटकों की अभिव्यक्ति के निषेध ने स्पष्ट रूप से ईआर तनाव से प्रेरित न्यूरिटिक शोष को तेज करना या देरी करना संभव बना दिया।
इस दृष्टिकोण का उपयोग ईआर तनाव के सेल सिस्टम मॉडल में न्यूराइट शोष के लिए न्यूरॉन्स की भेद्यता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) तनाव को किसी भी गड़बड़ी के रूप में परिभाषित किया गया है जो ऑर्गेनेल में प्रोटीन-फोल्डिंग क्षमता से समझौता करता है। ईआर लुमेन के भीतर अनफोल्डेड प्रोटीन का संचय एक ट्रांसडक्शन कैस्केड सिग्नल को सक्रिय करता है जिसे अनफोल्डेड प्रोटीन रिस्पॉन्स (यूपीआर) कहा जाता है। इस जटिल सिग्नलिंग मार्ग को तीन तनाव सेंसर द्वारा व्यवस्थित किया जाता है: पर्क (प्रोटीन किनेज आरएनए [पीकेआर]-जैसे ईआर काइनेज), आईआरई 1 (इनोसिटोल-आवश्यक एंजाइम 1) और एटीएफ 6 (सक्रिय प्रतिलेखन कारक 6)। सभी एक साथ होमियोस्टैसिस को बहाल करने का प्रयास करते हैं। लेकिन अगर तनाव बना रहता है, तो यूपीआर अंततः एपोप्टोसिस1 द्वारा कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है।
पर्क, ईआर तनाव पर एक ईआर ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन, यूकेरियोटिक दीक्षा कारक -2 अल्फा (ईआईएफ 2) के फॉस्फोराइलेशन की ओर जाता है, वैश्विक प्रोटीन संश्लेषण को कम करता है और इस प्रकार ईआर2 में प्रोटीन लोड होता है। हमने प्रदर्शित किया कि कैल्सिनयूरिन ए / बी (सीएनए / बी), एक हेटेरोडिमर सीए2 + फॉस्फेट, सीधे पर्क के साइटोसोलिक डोमेन को बांधता है, इसके ऑटो-फॉस्फोराइलेशन को बढ़ाता है और प्रोटीन अनुवाद और सेल व्यवहार्यता 3,4 के निषेध को काफी बढ़ाता है। दिलचस्प बात यह है कि स्तनधारी मस्तिष्क में सीएनए / बी प्रचुर मात्रा में है, जो सीएन के सबयूनिट ए के दो आइसोफॉर्म को अलग करता है: α और β।
निरंतर ईआर तनाव के तहत, पर्क सिग्नलिंग मार्ग एकमात्र यूपीआर शाखा है जो सक्रिय रहती है, इस प्रकार प्रो-सर्वाइवल और एपोप्टोटिक प्रतिक्रिया दोनों की मध्यस्थता करती है। क्रोनिक चरण में, एक प्रमुख डाउनस्ट्रीम घटना प्रतिलेखन कारक, सीएचओपी (सीसीएएटी / एन्हांसर बाइंडिंग प्रोटीन होमोलोगस प्रोटीन) 5 का प्रेरण है। क्रोनिक ईआर तनाव को न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों सहित पैथोलॉजिकल विकारों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक सामान्य योगदानकर्ता के रूप में भी पहचानाजाता है। यह समझना महत्वपूर्ण है कि यूपीआर कोशिका मृत्यु 7 के बजाय साइटोप्रोटेक्टिव सिग्नलिंग की सुविधा कैसे प्रदान कर सकता है। हालांकि, वर्तमान में इन दो यूपीआर चरणों के बीच संक्रमण को नियंत्रित करने वाले सटीक तंत्र के बारे में बहुत कम जानकारी है।
हाल ही में, हमने पाया कि, सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में, गैंग्लियासाइड जीएम 2 ईआर झिल्ली में जमा होता है और ल्यूमिनल कैल्शियम की कमी को प्रेरित करता है। यह बदले में पर्क सिग्नलिंग को सक्रिय करता है, जो न्यूराइट शोष और एपोप्टोसिस 8 की मध्यस्थता करता है। इस अध्ययन में, सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में जीएम 2 बिल्ड-अप का उपयोग ईआर तनाव-प्रेरित न्यूराइट शोष के सेल सिस्टम मॉडल के रूप में किया जाता है। विशेष रूप से, दो पर्क कारक अभिव्यक्तियों में हेरफेर किया जाता है, सीएन-ए और चॉप, जो प्रारंभिक / सुरक्षात्मक घटनाओं और एक पुरानी / एपोप्टोटिक चरण के बीच संक्रमण को बदल देता है। इसे पूरा करने के लिए, संबंधित जीनों को चुप करा दिया जाता है; इस प्रकार, प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन संस्कृतियां लेंटीवायरस-वितरित विशिष्ट एसएचआरएनए से संक्रमित होती हैं। वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण से नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में सीएन-ए और चॉप अभिव्यक्ति स्तरों में उल्लेखनीय कमी का पता चलता है, जो लेंटिवायरस से संक्रमित होते हैं जो एक स्क्रैम्बल्ड एसएचआरएनए लेते हैं। इस उपचार के बाद, न्यूरॉन्स को एक्सोजीनस जीएम 2 के विभिन्न इनक्यूबेशन समय के अधीन किया जाता है, जो एंटी-माइक्रोट्यूबुल्स से जुड़े प्रोटीन 2 (एमएपी 2) एंटीबॉडी 9 के साथ तय और इम्यूनोस्टेन्ड होताहै। छवियां एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त की जाती हैं। कुल न्यूराइट आउटग्रोथ का मूल्यांकन कुल सेल संख्या के सापेक्ष किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक प्रयोगात्मक प्रणाली का वर्णन करते हैं जो एक न्यूरोनल सेल मॉडल में जीवित रहने से एपोप्टोटिक यूपीआर चरणों में संक्रमण के आणविक मॉड्यूलेशन को सक्षम बनाता है।
न्यूराइट शोष के उचित विश्ले…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
गोंजालो क्वासोलो को इमेजिंग के साथ उनकी अमूल्य मदद के लिए और डॉ एंड्रिया पेलेग्रिनी को सेल संस्कृति तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं।
इस शोध को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, यूएसए (#RO1AG058778-01 ए 1, यूएचएससीएसएसए-इंस्टीट्यूटो इन्वेस्टिगासियोन मेडिका एम वाई एम फेरेरा के बीच सबवार्ड एग्रीमेंट नंबर 165148/165147) और नेशनल एजेंसी ऑफ एगेनसिया नेशनल डी साइंटिफिक एंड टेक्नोलॉजिकल प्रमोशन, अर्जेंटीना (एएनपीसाइट, पीआईसीटी 2017 # 0618)।
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 – 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actin | Thermo Fisher | # PA1 – 183 | |
| aprotinin | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 epifluorescence microscope | Zeiss | ||
| B27 supplement | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Fine-tippeds forceps style #5 | Dumont | ||
| Forcep style #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| lentiviral envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| lentiviral packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| lentiviral vector pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Leupeptin hemisulfate | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatin A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Straight sharp small spring scissors | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | #A1330 |
References
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