No presente estudo, a expressão é derrubada de dois componentes sinalizadores a jusante da via PERK, a calcineurina citoprotetora e o CHOP pró-apoptótico, utilizando shRNAs específicos. De maneiras opostas, eles modulam a suscetibilidade dos neurônios corticais primários à atrofia da neurite após a indução do estresse do retículo endoplasmático.
O acúmulo de proteínas desdobradas dentro do retículo endoplasmático (RE), causado por qualquer condição de estresse, desencadeia a resposta proteica desdobrada (UPR) através da ativação de sensores especializados. UPR tenta primeiro restaurar a homeostase; mas se o dano persistir, a sinalização induz a apoptose.
Há evidências crescentes de que o estresse ER sustentado e não resolvido contribui para muitas condições patológicas, incluindo doenças neurodegenerativas. Como a RPU controla o destino celular alternando entre processos citoprotetores e apoptóticos, é essencial entender os eventos que definem essa transição, bem como os elementos envolvidos em sua modulação.
Recentemente, demonstramos que o acúmulo anormal de gangliosídeos GM2 causa o esgotamento do conteúdo de ER Ca2+ , que por sua vez ativa a PERK (PKR-like-ER quinase), um dos sensores UPR. Além disso, a sinalização PERK participa da atrofia neurítica e da apoptose induzida pelo acúmulo de GM2. A este respeito, estabelecemos um sistema experimental que nos permite modular molecularmente a expressão de componentes PERK a jusante e, assim, alterar a vulnerabilidade dos neurônios para sofrer atrofia neurítica.
Realizamos knockdown da expressão de calcineurina (citoprotetora) e CHOP (pró-apoptótica) em culturas neuronais corticais de ratos. As células foram infectadas com shRNA específico entregue por lentivírus e, em seguida, tratadas com GM2 em diferentes momentos, fixadas e imunocoradas com anticorpo anti-MAP2 (proteína 2 associada a microtubos). Posteriormente, as imagens celulares foram registradas usando um microscópio de fluorescência e o crescimento total de neuritos foi avaliado usando o software de processamento de imagens de domínio público ImageJ. A inibição da expressão desses componentes de sinalização PERK claramente tornou possível acelerar ou retardar a atrofia neurítica induzida pelo estresse do RE.
Essa abordagem pode ser usada em modelos de sistema celular de estresse de RE para avaliar a vulnerabilidade dos neurônios à atrofia de neuritos.
O estresse do retículo endoplasmático (RE) é definido como qualquer perturbação que comprometa a capacidade de dobramento de proteínas na organela. O acúmulo de proteínas desdobradas dentro do lúmen do ER ativa um sinal de cascata de transdução chamado resposta proteica desdobrada (UPR). Esta via de sinalização complexa é orquestrada por três sensores de estresse: PERK (proteína quinase RNA [PKR]-like ER quinase), IRE1 (enzima 1 que requer inositol) e ATF6 (fator de transcrição ativado 6). Todos juntos tentam restaurar a homeostase. Mas se o estresse persistir, a RPU eventualmente induz a morte celular por apoptose1.
PERK, uma proteína transmembrana de RE, sob estresse de RE, lidera a fosforilação do fator de iniciação eucariótico-2 alfa (eIF2α), reduzindo a síntese proteica global e, portanto, a carga proteica no RE2. Demonstramos que a calcineurina A/B (CNA/B), um heterodímero Ca2+ fosfatase, liga-se diretamente ao domínio citosólico da PERK, aumentando sua autofosforilação e aumentando significativamente a inibição da tradução de proteínas e a viabilidade celular 3,4. Curiosamente, o CNA/B é abundante no cérebro de mamíferos, distinguindo duas isoformas da subunidade A do CN: α e β.
Sob estresse sustentado do RE, a via de sinalização PERK é o único ramo UPR que permanece ativado, mediando assim tanto a resposta pró-sobrevivência quanto a resposta apoptótica. Na fase crônica, um dos principais eventos a jusante é a indução do fator de transcrição, CHOP (CCAAT/enhancer binding protein homóloga protein)5. O estresse crônico do RE também é cada vez mais reconhecido como um contribuinte comum para uma extensa gama de distúrbios patológicos, incluindo doenças neurodegenerativas6. É importante compreender como a RPU pode facilitar a sinalização citoprotetora em vez da morte celular 7. No entanto, atualmente pouco se sabe sobre o mecanismo exato que controla a transição entre essas duas fases da RPU.
Recentemente, descobrimos que, em neurônios cultivados, o gangliosídeo GM2 se acumula nas membranas do RE e induz a depleção de cálcio luminal. Isso, por sua vez, ativa a sinalização PERK, que medeia a atrofia neurítica e a apoptose 8. Neste estudo, o acúmulo de GM2 em neurônios cultivados é usado como um modelo de sistema celular de atrofia de neurite induzida por estresse de ER. Especificamente, duas expressões do fator PERK são manipuladas, CN-Aα e CHOP, o que alterna a transição entre eventos precoces/protetores e uma fase crônica/apoptótica. Para conseguir isso, os respectivos genes são silenciados; assim, as culturas primárias de neurônios corticais são infectadas com shRNA específico entregue por lentivírus. A análise de Western blot revela uma redução significativa dos níveis de expressão de CN-Aα e CHOP em comparação com as células de controle, que estão infectadas com lentivírus que carregam um shRNA embaralhado. Após esse tratamento, os neurônios são submetidos a diferentes tempos de incubação de GM2 exógeno, fixo e imunocorado com anticorpo anti-proteína 2 associada a microtúbulos (MAP2)9. As imagens são obtidas com um microscópio de epifluorescência. O crescimento total de neuritos é avaliado em relação ao número total de células.
Descrevemos um sistema experimental que permite a modulação molecular da transição das fases de sobrevida para UPR apoptótica em um modelo celular neuronal.
Para uma análise adequada da atrofia neurítica, é essencial a obtenção de culturas primárias de neurônios com processos numerosos, longos e altamente ramificados 9,11. Isso facilita o exame da extensão do processo dos neurônios, permitindo que as diferenças claras en…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Dr. Gonzalo Quasollo por sua inestimável ajuda com imagens e à Dra. Andrea Pellegrini pelo suporte técnico de cultura celular.
Esta pesquisa foi apoiada por bolsas de: National Institute of Health, EUA (#RO1AG058778-01A1, Subaward Agreement No 165148/165147 entre UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) e da Agência Nacional de Promoção Científica e Tecnológica, Argentina (ANPCyT, PICT 2017 #0618).
Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 – 250 | |
Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
anti-β-actin | Thermo Fisher | # PA1 – 183 | |
aprotinin | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
Axiovert 200 epifluorescence microscope | Zeiss | ||
B27 supplement | Life Technologies | #17504944 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
EcoRI | Promega | #R6011 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
Fine-tippeds forceps style #5 | Dumont | ||
Forcep style #3 | Dumont | ||
HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
IRDye 680 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
IRDye 680 secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
lentiviral envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
lentiviral packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
lentiviral vector pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
Leupeptin hemisulfate | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent) | Life Technologies | #A12621 | |
MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
Nitrocellulose membrane 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
Odyssey infrared imaging system | LI-COR Bioscience | ||
OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
PacI | BioLabs | #R0547S | |
penicillin-streptomycin | Life Technologies | #15140122 | |
Pepstatin A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
Straight sharp small spring scissors | Fine Science Tools | ||
T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
Wizard plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | #A1330 |