慢病毒递送的特异性shRNA在内质网应激神经元中的分子调节
Summary
在本研究中，通过使用特定的shRNA敲低PERK途径的两个下游信号成分，即细胞保护性钙调磷酸酶和促凋亡CHOP的表达。相反，这些调节原代皮质神经元在诱导内质网应激后对神经突萎缩的易感性。
Abstract
由任何应激条件引起的内质网（ER）内未折叠蛋白质的积累，通过激活专用传感器触发未折叠蛋白质反应（UPR）。普遍定期审议首先试图恢复体内平衡;但如果损伤持续存在，信号传导诱导细胞凋亡。
越来越多的证据表明，持续和未解决的ER压力会导致许多病理状况，包括神经退行性疾病。由于UPR通过在细胞保护和凋亡过程之间切换来控制细胞命运，因此必须了解定义这种转变的事件以及参与其调节的元素。
最近，我们证明了异常的GM2神经节苷脂积累导致ERCa 2+ 含量的消耗，这反过来又激活了UPR传感器之一的PERK（PKR样ER激酶）。此外，PERK信号传导参与GM2积累诱导的神经突萎缩和细胞凋亡。在这方面，我们已经建立了一个实验系统，使我们能够分子调节下游PERK成分的表达，从而改变神经元经历神经炎萎缩的脆弱性。
我们在大鼠皮质神经元培养物中敲低钙调磷酸酶（细胞保护）和CHOP（促凋亡）表达。细胞感染慢病毒递送的特异性shRNA，然后在不同时间用GM2处理，固定并用抗MAP2（微管相关蛋白2）抗体免疫染色。之后，使用荧光显微镜记录细胞图像，并使用公共领域图像处理软件ImageJ评估总神经突生长。抑制这些PERK信号成分的表达显然使得加速或延缓ER应激诱导的神经炎萎缩成为可能。
这种方法可用于ER应激的细胞系统模型，以评估神经元对神经突萎缩的脆弱性。
Introduction
内质网（ER）应激被定义为任何损害细胞器中蛋白质折叠能力的扰动。ER腔内未折叠蛋白的积累激活转导级联信号，称为未折叠蛋白反应（UPR）。这种复杂的信号通路由三个压力传感器协调：PERK（蛋白激酶RNA [PKR]样ER激酶），IRE1（需要肌醇的酶1）和ATF6（活化转录因子6）。所有人都试图恢复体内平衡。但如果压力持续存在，UPR最终会通过细胞凋亡1诱导细胞死亡。
PERK 是一种 ER 跨膜蛋白，在 ER 应激下，导致真核起始因子-2 α （eIF2α） 的磷酸化，从而减少全局蛋白质合成，从而减少 ER2 中的蛋白质载量。我们证明了钙调磷酸酶A / B（CNA / B），一种异二聚体Ca2+ 磷酸酶，直接结合PERK的胞质结构域，增加其自身磷酸化并显着增强对蛋白质翻译和细胞活力的抑制3，4。有趣的是，CNA / B在哺乳动物大脑中含量丰富，区分了CN亚基A的两种亚型：α和β。
在持续的ER应激下，PERK信号通路是唯一保持激活的UPR分支，从而介导促生存和凋亡反应。在慢性期，一个主要的下游事件是转录因子CHOP（CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白）的诱导5。慢性ER应激也越来越被认为是包括神经退行性疾病在内的各种病理性疾病的共同因素6。重要的是要了解UPR如何促进细胞保护信号传导而不是细胞死亡 7。然而，目前对控制这两个普遍定期审议阶段之间过渡的确切机制知之甚少。
最近，我们发现，在培养的神经元中，神经节苷脂GM2积聚在ER膜中并诱导管腔钙耗竭。这反过来又激活了PERK信号传导，其介导神经突萎缩和细胞凋亡 8。在这项研究中，培养神经元中的GM2积聚被用作ER应激诱导的神经突萎缩的细胞系统模型。具体来说，操纵两种PERK因子表达，CN-Aα和CHOP在早期/保护性事件和慢性/凋亡期之间切换转换。为了实现这一目标，相应的基因被沉默;因此，原代皮质神经元培养物感染慢病毒递送的特异性shRNA。蛋白质印迹分析显示，与感染携带混乱shRNA的慢病毒的对照细胞相比，CN-Aα和CHOP表达水平显着降低。在此处理后，神经元经受外源性GM2的不同孵育时间，固定并用抗微管相关蛋白2（MAP2）抗体9进行免疫染色。使用落射荧光显微镜获得图像。相对于总细胞数评估总神经突生长。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们描述了一种实验系统，该系统能够在神经元细胞模型中对从存活期到凋亡UPR期的过渡进行分子调节。
为了正确分析神经突萎缩，必须获得具有许多长而高度分支过程的原代神经元培养物9，11。这有助于检查神经元过程延伸，从而可以检测到治疗之间的明显差异。重要的是要注意，如果体外7-8天的原代皮质神经元培养物已经显示…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Gonzalo Quasollo博士在成像方面的宝贵帮助，并感谢Andrea Pellegrini博士的细胞培养技术支持。
这项研究得到了美国国立卫生研究院（#RO1AG058778-01A1，UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra之间的第165148/165147号子奖励协议）和阿根廷国家科技促进机构（ANPCyT，PICT 2017 #0618）的资助。
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 – 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actin | Thermo Fisher | # PA1 – 183 | |
| aprotinin | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 epifluorescence microscope | Zeiss | ||
| B27 supplement | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Fine-tippeds forceps style #5 | Dumont | ||
| Forcep style #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| lentiviral envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| lentiviral packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| lentiviral vector pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Leupeptin hemisulfate | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatin A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Straight sharp small spring scissors | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | #A1330 |
References
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