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Biochemistry

Complementazione dell'attività di splicing da parte di un complesso snRNP Galectin-3 - U1 su perline

Published: December 9, 2020 doi: 10.3791/61990
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University

Summary

Questo articolo descrive le procedure sperimentali per (a) l'esaurimento di U1 snRNP da estratti nucleari, con concomitante perdita di attività di splicing; e (b) ricostituzione dell'attività di splicing nell'estratto impoverito di U1 da particelle di galectina-3 - U1 snRNP legate a perline accoppiate covalentemente con anticorpi anti-galectina-3.

Abstract

I classici esperimenti di deplezione-ricostituzione indicano che la galectina-3 è un fattore di giunzione richiesto negli estratti nucleari. Il meccanismo di incorporazione della galectina-3 nella via di giunzione è affrontato in questo documento. La sedimentazione di estratti nucleari di cellule HeLa su gradienti di glicerolo del 12% -32% produce frazioni arricchite in una particella endogena ~ 10S che contiene galectina-3 e U1 snRNP. Ora descriviamo un protocollo per esaurire gli estratti nucleari di U1 snRNP con concomitante perdita di attività di splicing. L'attività di splicing nell'estratto impoverito di U1 può essere ricostituita dalla particella galectina-3 - U1 snRNP intrappolata su perle di agarosio accoppiate covalentemente con anticorpi anti-galectina-3. I risultati indicano che il complesso ternario galectina-3 - U1 snRNP - pre-mRNA è un complesso E funzionale che porta a intermedi e prodotti della reazione di splicing e che la galectina-3 entra nella via di splicing attraverso la sua associazione con U1 snRNP. Lo schema di utilizzo di complessi affinati o immunoselezionati su perline per ricostituire l'attività di giunzione in estratti impoveriti di uno specifico fattore di giunzione può essere generalmente applicabile ad altri sistemi.

Introduction

La produzione della maggior parte degli RNA messaggeri eucariotici (mRNA) comporta la rimozione degli introni e la legatura degli esoni in un processo nucleare chiamato splicing pre-mRNA1. Due classi di complessi RNA-proteina (RNP) dirigono l'elaborazione dell'RNA pre-messaggero in mRNA maturo tramite complessi spliceosomiali. Una classe, i nascenti RNP pre-messaggeri, è formata co-trascrizionalmente dal legame di proteine RNP nucleari eterogenee e altre proteine leganti l'RNA, inclusi alcuni membri della famiglia SR, producendo complessi hnRNP2. La seconda classe, piccoli RNP nucleari ricchi di uracile (U snRNPs con U1, U2, U4, U5 e U6 snRNA) è associata a proteine U-specifiche e core3,4. Gli U snNP interagiscono in modo ordinato con regioni specifiche di RNP pre-messaggeri in un percorso di rimodellamento dinamico mentre gli introni vengono asportati e gli esoni vengono legati per produrre mRNPs maturi5. Molte altre proteine nucleari partecipano a questi eventi di elaborazione6.

Galectin-1 (Gal1) e galectin-3 (Gal3) sono due proteine che sono fattori richiesti nella via di splicing, come dimostrato da studi di deplezione-ricostituzione7,8. La rimozione di entrambe le galectine dallo splicing di estratti nucleari competenti (NE) abolisce l'assemblaggio dello spliceosoma e l'attività di splicing in una fase precoce. L'aggiunta di una galectina a un NE così doppiamente impoverito ripristina entrambe le attività. Gal1 e Gal3 sono componenti di spliceosomi attivi, come evidenziato da immunoprecipitazione specifica di pre-mRNA, intermedi splicing e mRNA maturo mediante antisiero specifico per Gal1 o Gal39. È importante sottolineare che Gal3 si associa a u snRNA endogeni contenenti particelle nel NE al di fuori della via di splicing, come mostrato dalla precipitazione di snNP da anti-Gal3 antisera10. Infine, il silenziamento di Gal3 nelle cellule HeLa altera i modelli di splicing di numerosi geni11.

Nei NE pre-incubati per smontare spliceosomi preformati12, gli snRP si trovano in complessi multipli che sedimentano in gradienti di glicerolo da 7S a superiori a 60S. Sebbene il frazionamento con gradiente di glicerolo sia una tecnica comune per l'isolamento di complessi e componenti spliceosomiali (vedi riferimenti13,14,15 per esempio), abbiamo esteso questo metodo caratterizzando frazioni specifiche utilizzando immunoprecipitazioni anticorpali. Un sedimento snRNP a 10S contiene solo SnRNA U1 insieme a Gal3. L'immunoprecipitazione della frazione 10S con antisieri specifici per Gal3 o U1 snRNP co-precipita sia U1 che Gal3 indicando che alcune delle monoparticelle U1 snRNP sono legate a Gal310. Poiché U1 snRNP è il primo complesso che si lega al pre-mRNP nell'assemblaggio spliceosomiale1,5, questo passaggio rappresenta un potenziale sito di ingresso per Gal3 nella via di giunzione. Su questa base, abbiamo dimostrato che le monoparticelle di 10S Gal3-U1 snRNP legate a perline contenenti anti-Gal3 hanno ripristinato l'attività di splicing a un NE impoverito di SnRNP U1, stabilendo questo complesso come un meccanismo con cui Gal3 viene reclutato nella via spliceosomiale16. Ciò contrasta con i tentativi di isolare gli spliceosomi in fasi specifiche della reazione di splicing e di catalogare i fattori associati17,18. In tali studi, viene accertata la presenza di determinati fattori ad un certo punto del tempo, ma non il meccanismo con cui sono stati caricati.

In precedenza avevamo descritto in dettaglio la preparazione del NE, il substrato di splicing, l'assemblaggio della miscela di reazione di splicing e l'analisi dei prodotti nella nostra documentazione del ruolo delle galectine nello splicing pre-mRNA19. Descriviamo ora le procedure sperimentali per il frazionamento di estratti nucleari per ottenere una frazione arricchita nel complesso Gal3 - U1 snRNP e per l'immunoselezione di quest'ultimo complesso per ricostituire l'attività di splicing in un estratto nucleare impoverito di U1.

Figure 1
Figura 1: Diagramma schematico che illustra la complementazione dell'attività di splicing nell'estratto nucleare impoverito di U1 snRNP da un complesso snRNP Gal3-U1 su perline. (A) NE nel Buffer C (NE(C)) è incubato con perline di proteina A-sefarosio accoppiate covalentemente con snRNP anti-U1 (αU1 perline). La frazione non legata è impoverita di U1 snRNP (U1ΔNE). (B) NE nel tampone D (NE(D)) è frazionato su un gradiente di glicerolo del 12%-32% mediante ultracentrifugazione. Le frazioni corrispondenti alla regione 10S (frazioni 3-5) sono combinate e mescolate con perline accoppiate covalentemente con anticorpi anti-Gal3 (perline αGal3). Il materiale legato alle perline contiene una monoparticella Gal3-U1 snRNP. (C) Il complesso Gal3-U1 snRNP della Parte (B) viene miscelato con U1ΔNE della Parte (A) in un test di giunzione utilizzando substrato pre-mRNA MINX marcato con 32P e gli intermedi e i prodotti della reazione di splicing vengono analizzati mediante elettroforesi su gel e autoradiografia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocol

1. Note sulle procedure generali

  1. Assicurarsi che tutte le sostanze chimiche (componenti tampone, enzimi, ecc.) siano mantenute libere da ribonucleasi (RNasi). Sequestrare tutte le bottiglie di reagente acquistate commercialmente dall'uso generale del laboratorio. Indossare guanti per tutte le fasi della procedura sperimentale. Utilizzare solo bicchieri e utensili che sono stati cotti (vedere il passaggio 1.2 di seguito) e soluzioni che sono state pretrattate (vedere il passaggio 1.3 di seguito).
  2. Cuocere tutti gli oggetti di vetro (bicchieri, boccette, bottiglie, pipette, ecc.) per un minimo di 4 ore a 177 °C. Avvolgere altri utensili (spatole, barre di agitazione, ecc.) in un foglio di alluminio prima di cuocere nelle stesse condizioni.
  3. Preparare una soluzione allo 0,1% (vol/vol) di dietilpirocarbonato (DEPC) in acqua a doppia distillazione (ddH2O). Utilizzando una barra magnetica, mescolare questa soluzione durante la notte e quindi autoclave. Utilizzare questo H2O trattato con DEPC per realizzare tutte le soluzioni contenenti Tris; quindi, filtrare sterilizzare utilizzando un filtro a vuoto superiore della bottiglia. Utilizzare ddH2O regolare per preparare tutte le altre soluzioni (senza Tris); quindi, trattare con DEPC (0,1%, vol / vol) e autoclave.
    NOTA: i buffer utilizzati nel seguente insieme di procedure sperimentali sono elencati in ordine alfabetico nella Tabella 1.
Nome del buffer Composizione
Tampone di borato 0,2 M borato di sodio, pH 9
Buffer C 20 mM HEPES, pH 7,9, 25% (vol/vol) glicerolo, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), 0,5 mM ditiotreitolo (DTT)
Buffer D 10 mM HEPES, pH 7,9, 20% (vol/vol) glicerolo, 0,1 M KCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 0,5 mM DTT
60%D 60% Buffer D e 40% H2O
Etanolamina 0,2 M etanolamina, pH 8
Buffer di legame HEPES 20 mM HEPES, pH 7,9
Tampone di lavaggio HEPES 20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 M NaCl
Tampone di carico dell'RNA 90% formammide, 20 mM EDTA, pH 8, 0,05% (p/v) blu bromofenolo
Buffer SDS-PAGE 25 mM Tris, 169 mM glicina, 0,1% sodio dodecil solfato (SDS), pH 8,8
Buffer di esempio SDS 62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerolo, 5% 2-mercaptoetanolo, 0,1% (p/v) blu bromofenolo
Tampone TBE per gel di RNA 89 mM Tris, 89 mM acido borico, 2,5 mM EDTA, pH 8,3
Buffer TE 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA
Buffer di trasferimento 25 mM Tris, 1,92 M glicina, 20% metanolo, pH 8,3
Buffer T-TBS 10 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,5
Tampone di lavaggio TX 0,05% Triton X-100 (TX) in 60%D

Tabella 1: Nome e composizione dei buffer

2. Preparazione di NE impoverito di U1 snRNP (U1 ΔNE)

  1. Preparazione di perline anti-U1 per l'immunoadsorbimento
    1. Pre-gonfiare 50 mg di proteine A-sefarosio CL-4B perline in eccesso di H2O trattato con DEPC per produrre circa 200 μL di perline gonfie e quindi lavare nel tampone di lavaggio HEPES.
    2. Per questo lavaggio e tutti i lavaggi successivi, pellet le perline mediante centrifugazione (1.000 x g in un rotore a benna oscillante a 4 °C per 10-15 s) e rimuovere il lavaggio non legato utilizzando un micropipetto e scartare.
    3. Mescolare 150 μL di perline lavate con 150 μL di siero autoimmune umano specifico per U1 snRNP (volume di anticorpi rispetto al volume di perline in un rapporto di 1:1).
    4. Regolare, sulla base del volume totale di (~300 μL dal punto 2.1.3 sopra), la miscela a 20 mM HEPES, pH 7,9, corrispondente alle condizioni del tampone legante HEPES; incubare questa miscela con dondolo continuo a temperatura ambiente per 60 min.
    5. Lavare le perline legate con anticorpi con 1 mL di tampone borato (0,2 M borato di sodio, pH 9) e risospese in 1 mL dello stesso tampone borato.
    6. Per accoppiare covalentemente l'anticorpo legato alle perle di proteina A-sefarosio, aggiungere dimetilpimilamidato a una concentrazione finale di 20 mM e incubare a temperatura ambiente con oscillazione per 60 minuti.
    7. Lavare le perline con 1 mL di tampone borato.
    8. Per bloccare qualsiasi reagente reticolante non reagito, aggiungere 1 mL di etanolamina 0,2 M (pH 8) e incubare a temperatura ambiente con dondolo per 60 minuti.
    9. Lavare le perle accoppiate agli anticorpi, di seguito designate come perle anti-U1, due volte con 0,5 mL di tampone di lavaggio TX (0,05% Triton X-100 in 60% D).
  2. Esaurimento di U1 snRNP da NE (vedi Figura 1A)
    NOTA: La procedura per la preparazione di NE da cellule HeLa è stata inizialmente sviluppata da Dignam et al.20. Abbiamo descritto i materiali e i metodi dettagliati per la preparazione di NE per i saggi di giunzione19 (vedere i passaggi 2.1 e 3.1 di tale riferimento). NE, come inizialmente preparato, si trova nel buffer C e sarà in seguito designato come NE(C). NE(C) dializzato ed equilibrato con il Buffer D sarà designato come NE(D).
    1. Incubare 200 μL di NE(C) con 100 μL di perline anti-U1 dal punto 2.1.9 di cui sopra.
    2. Aggiungere 5 μL di RNasin alla miscela.
    3. Ruotare il microtubo testa-sopra-coda a 4 °C per 1 ora.
    4. Pellettizzare la miscela per centrifugazione (1.000 x g in un rotore a benna oscillante a 4 °C per 10-15 s) e raccogliere il materiale non legato (U1ΔNE) utilizzando una siringa Hamilton.
    5. Dializzare l'intero volume di U1ΔNE, insieme a un'aliquota separata di 50 μL del NE(C) non disapletato originale, in compartimenti separati di un microdializzatore, con agitazione, per 75 minuti contro il 60% D utilizzando una membrana di dialisi con taglio di peso molecolare di 8 K.
    6. Immediatamente dopo la dialisi, dividere questi preparati (U1ΔNE e NE in 60% D) in aliquote da 20 μL; quindi congelare a scatto in un bagno di ghiaccio secco/etanolo e conservare a -80 °C.
  3. Analisi del contenuto di RNA e proteine di U1ΔNE e materiale legato su perline anti-U1
    1. Dopo la rimozione del materiale non legato (U1ΔNE) (punto 2.2.4), lavare il materiale legato alle perle anti-U1 aggiungendo 0,5 mL di tampone di lavaggio TX. Pellet la miscela per centrifugazione (1.000 x g in un rotore a benna oscillante a 4 °C per 10-15 s) e rimuovere il surnatante usando un micropipetto e scartare.
    2. Ripetere due volte i passaggi di lavaggio 2.3.1.
    3. Rimuovere il materiale legato alle perle anti-U1 aggiungendo 100 μL di 2x tampone campione SDS a 100 μL delle perline e incubando per 10 minuti a temperatura ambiente.
    4. Pellet la miscela per centrifugazione (1.000 x g in un rotore a benna oscillante a 4 °C per 10-15 s); rimuovere il surnatante della siringa Hamilton e congelare a scatto in un bagno di ghiaccio secco/etanolo. Conservare a -80 °C.
    5. Confrontare il NE non delegato, il NE impoverito (U1ΔNE) e il materiale legato alle perline (rimosso dalle perline dal buffer del campione SDS come descritto nei passaggi 2.3.3 e 2.3.4 sopra). Seguire i passaggi 2.3.6-2.3.8 per l'analisi dell'RNA o i passaggi 2.3.9-2.3.10 per l'analisi delle proteine.
    6. Per ogni campione, estrarre l'RNA con 200 μL di fenolo-cloroformio (50:50, v/v); quindi estrarre nuovamente con 180 μL di alcool cloroformio-isoamilico (25:1, v/v). Dopo l'estrazione, aggiungere 300 μL di etanolo freddo a prova di 200, invertire per miscelare e conservare l'RNA precipitato durante la notte a -20 °C.
    7. Centrifugare l'RNA precipitato con etanolo (12.000 x g per 10 minuti a 4 °C). Lavare il pellet con 150 μL di etanolo freddo al 70%. Centrifugare nuovamente (12.000 x g) a 4 °C per 15 min. Rimuovere il surnatante utilizzando un micropipetto e asciugare il pellet in una velocità vac per 10-15 minuti senza calore.
    8. Sospendere il pellet di RNA essiccato in 10 μL di tampone di carico dell'RNA, vortice delicatamente, riscaldare a 75-85 °C per 90 s, quindi incubare sul ghiaccio per 2 minuti. Separare gli snRNA mediante elettroforesi su gel (2 ore a 16 mA) attraverso il 13% di poliacrilammide - gel di urea 8,3 M e quindi colorare con bromuro di etidio o soggetto a northern blotting10,16.
    9. Caricare i campioni proteici, in tampone campione SDS dallo stadio 2.3.5, su gel di poliacrilammide al 12,5% ed elettroforesi a 200 V per circa 45-50 minuti in tampone SDS-PAGE (elettroforesi del gel poliacrilammidico dodecilsolfato di sodio).
    10. Trasferire le proteine separate sulla membrana nitrocellulosa a 400 mA per 2 ore nel tampone di trasferimento. Dopo il trasferimento, bloccare la membrana incubando durante la notte in T-TBS contenente il 10% di latte secco non grasso. Quindi, immunoblot la membrana per rivelare proteine specifiche8,21.

3. Immunoprecipitazione di frazioni 10S di gradienti di glicerolo da parte di anti-Gal3

  1. Preparazione di perline anti-Gal3 per l'immunoadsorbimento
    NOTA: La derivazione e la caratterizzazione degli antisieri policlonali di coniglio contro Gal3 per coniglio #2421 e per coniglio #4910 sono state descritte in precedenza.
    1. Utilizzare il siero preimmune del coniglio #49 come controllo.
    2. Per la preparazione di perline anti-Gal3 seguire la procedura precedentemente descritta per la preparazione di perline anti-U1 (fase 2.1), con l'eccezione che corrispondente al passaggio 2.1.3, il rapporto tra antisiero (ad esempio, anti-Gal3, #49) e perline è 3: 1.
    3. Poco prima dell'uso, lavare le perle accoppiate agli anticorpi, di seguito designate come perline anti-Gal3, due volte con 0,5 ml di tampone di lavaggio TX. Rimuovere il surnatante, prima con un micropipettatore per estrarre la maggior parte del liquido e poi con una siringa hamilton per estrarre il liquido dalle perline; scartare.
  2. Immunoprecipitatoton delle frazioni del gradiente di glicerolo da parte di anti-Gal3 (vedi Figura 1B)
    1. Frazionare NE(D) su un gradiente di glicerolo del 12%-32%10. Combinare e mescolare le frazioni di gradiente di glicerolo 3, 4 e 5 (numerate dalla parte superiore del gradiente), che si trovano vicino alla regione 10S del gradiente.
    2. Preparare due campioni, ciascuno con aliquota di 150 μL di frazioni di gradiente combinate 3-5 (fase 3.2.1), e posizionare in 50 μL di perline anti-Gal3.
    3. In parallelo, preparare due campioni ciascuno con 150 μL di frazione 1 (contenente Gal3 non in complesso con U1 snRNP10; fase 3.2.1) e inserire in 50 μL di perline anti-Gal3.
    4. Come controllo, posizionare 150 μL di 60% D in un altro microtubo di 50 μL di perline anti-Gal3.
    5. Mescolare delicatamente picchiettando il tubo, quindi ruotare il microtubo testa-sopra-coda a 4°C per 1 ora.
    6. Pellet la miscela mediante centrifugazione delicata (1.000 x g in un rotore a benna oscillante a 4 °C per 10-15 s).
    7. Rimuovere il surnatante (materiale non legato) utilizzando una siringa hamilton. Non lavare le perline e usare immediatamente per l'aggiunta delle reazioni di giunzione (punto 4.2).
  3. Analisi del contenuto di RNA e proteine nel materiale non legato e legato dalla precipitazione anti-Gal3 di frazioni di gradiente 10S
    1. Per l'analisi dei componenti del materiale legato e non legato dalla precipitazione anti-Gal3 delle frazioni di gradiente 10S, raccogliere il materiale non legato (surnatante dopo il passaggio 3.2.6), trasferirlo in un microtubo fresco e congelare a -20 °C.
    2. Lavare le perline precipitate dal punto 3.2.6 (contenente materiale legato all'anti-Gal3) aggiungendo 0,5 mL di tampone di lavaggio TX.
    3. Pellet la miscela mediante centrifugazione delicata (1.000 x g in un rotore a benna oscillante a 4 °C per 10-15 s); rimuovere il surnatante usando un micropipettor e scartare. Ripetere i passaggi di lavaggio altre due volte.
    4. Aggiungere 50 μL di tampone campione 2X SDS alle perline anti-Gal3 lavate e pellettate.
    5. Mescolare delicatamente le perline e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
    6. Pellet la miscela mediante centrifugazione delicata (1.000 x g in un rotore a benna oscillante a 4 °C per 10-15 s), raccogliere il surnatante della siringa Hamilton e conservare in un microtubo fresco a -20 °C.
    7. Confrontare il materiale non legato (sezione 3.3.1) e il materiale legato (punto 3.3.6) della precipitazione anti-Gal3 in termini di RNA e componenti proteici, utilizzando le procedure descritte nei passaggi 2.3.6. al 2.3.10, rispettivamente.

4. Assemblaggio della reazione di giunzione e analisi dei prodotti

  1. Preparazione del substrato di giunzione
    NOTA: il substrato pre-mRNA, designato MINX, contiene due sequenze di esoni e una sequenza di introne da Adenovirus22. La sequenza di DNA MINX nel plasmide è sotto il controllo dei promotori della RNA polimerasi T3, T7 o SP6. I materiali e i metodi dettagliati per la linearizzazione del DNA plasmidico MINX con endonucleasi di restrizione BamHI, la trascrizione da parte di SP6 RNA polimerasi in presenza di α-32P[GTP] e la purificazione di MINX marcata con 32P per saggi di splicing sono descritti in precedenza19 (vedi passaggi 2.2 e 3.2 di tale riferimento).
    1. Conservare il MINX radiomarcato come precipitato di etanolo a -20 °C; utilizzare il substrato di splicing etichettato entro 4-6 settimane dalla trascrizione.
    2. Poco prima dell'uso, centrifugare l'etanolo precipitato 32P-marcato MINX a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C; rimuovere il surnatante con un micropipettor e scartare.
    3. Aggiungere 150 μL di etanolo al 70% e centrifugare a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e asciugare il pellet in speed vac senza calore per 15 min.
    4. Reidratare il pellet in 50 μL di acqua DEPC. Spot 2 μL su ciascuno dei due filtri GF/C; immergere i filtri in acido tricloroacetico freddo al 5% (TCA) per 10 min. Risciacquare con TCA freddo al 5%, seguito da etanolo a prova di 180 su un pallone sottovuoto. Asciugare ad aria i filtri e sottoporre a scintillazione il conteggio in 4 mL di Safety-Solve.
    5. Diluire MINX marcato con 32P nel 60% D a 104 cpm/μL per il test di giunzione.
  2. Assemblaggio della reazione di giunzione (vedi Figura 1C)
    1. Assemblare, su ghiaccio, le reazioni di giunzione in un volume totale di 24 μL (8 μL U1ΔNE (dal passo 2.2.6), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM creatina fosfato, 0,5 mM DTT, 20 unità RNasin, 4 μL 32P-marcato SUBSTRATO di giunzione MINX (104 cpm/μL), 60% D) e aggiungere a ciascun tubo di perline dal paragrafo 3.2.7. Assemblare un insieme identico di reazioni di giunzione in un volume totale di 24 μL ma senza U1ΔNE e aggiungere a ciascun tubo di perline dal punto 3.2.7.
    2. Preparare una reazione di splicing di controllo in un volume totale di 12 μL (4 μL NE(D), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM creatina fosfato, 0,5 mM DTT, 20 unità RNasin, 2 μL 32P-marcato SUBSTRATO DI GIUNzione MINX (104 cpm/μL), 60% D).
    3. Mescolare delicatamente i tubi picchiettando e ruotare end-over-tail a 30°C per 90 min. Pellet la miscela mediante centrifugazione delicata a 1.000 x g in un rotore a benna oscillante a 4 °C per 10-15 s.
    4. Arrestare la reazione ed eluire le proteine dalle perline aggiungendo 24 μL di 2x tampone campione SDS alle provette contenenti perline e 12 μL di 2x tampone campione SDS alla provetta di controllo contenente NE ma senza perline. Riscaldare i tubi a 100 °C per 7 min.
    5. Centrifugare delicatamente i tubi a 1.000 x g in un rotore a benna oscillante a 4 °C per 10-15 s.
    6. Trasferire i supernatanti (eluizioni) in microtubi freschi: circa 48 μL dai tubi di perline e 24 μL dal tubo di controllo NE.
    7. Aggiungere la proteinasi K (20 mg/mL) per digerire e solubilizzare le proteine: aggiungere 5 μL all'eluizione di 48 μL dalle perline e aggiungere 2,5 μL al controllo NE da 24 μL.
    8. Incubare i tubi a 37°C per 40 min.
    9. Centrifugare delicatamente i tubi a 1.000 x g in un rotore a benna oscillante a 4 °C per 10 s.
    10. Diluire le eluizioni di perline con 39,5 μL te e 10 μL 3 M acetato di sodio. Diluire il controllo NE con 63,5 μL TE e 10 μL 3 M acetato di sodio.
    11. Estrarre e analizzare l'RNA come descritto di seguito (paragrafo 4.3).
  3. Analisi dei prodotti della reazione di giunzione
    1. Estrarre gli RNA in ogni campione con fenolo-cloroformio, seguito da alcool cloroformio-isoamilico; precipitare gli RNA con etanolo, centrifugare, lavare i pellet, rimuovere il surnatante e asciugare i pellet seguendo la stessa procedura descritta ai punti 2.3.6 e 2.3.7.
    2. Sospendere il pellet di RNA essiccato in 10 μL di tampone di carico dell'RNA, vortice delicatamente, riscaldare a 75-85 °C per 90 s, quindi incubare sul ghiaccio per 2 minuti.
    3. Preparare 20 mL di una soluzione contenente il 13% di poliacrilammide (bisacrilammide:acrilammide, 1,9:50 [wt/wt]) in urea 8,3 M; gel fusi di 15 cm di lunghezza utilizzando questa soluzione.
    4. Una volta che il gel è stato colato, elettroforesizzarlo (senza alcun campione caricato) a 400 V per 20 minuti utilizzando TBE come buffer di funzionamento. Dopo questo passaggio, lavare i pozzetti con il buffer di esecuzione TBE.
    5. Caricare i campioni di RNA, nel buffer di carico dell'RNA, ed elettroforesi con buffer tbe funzionante a 400 V per 3,5-4 ore. Dopo l'elettroforesi, rimuovere l'urea immergendo e ruotando il gel in acqua distillata per 10 minuti.
    6. Asciugare sottovuoto il gel su carta da filtro da 3 M, prima per 2 h 15 min a 80 °C e poi per 30 min senza calore per raffreddarlo lentamente. Sottoporre il gel essiccato ad autoradiografia su pellicola per rilevare le posizioni di migrazione dei componenti radioattivi.

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Representative Results

NE impoverito di U1 snRNP (U1ΔNE dalla Sezione 2.2.6) e Gal3 - U1 snRNP complessi della regione 10S del gradiente del glicerolo immunoprecipitato da anti-Gal3 (fase 3.2.7) sono stati miscelati in una reazione di splicing. Questa miscela di reazione conteneva SnRNA U1 (Figura 2A, corsia 3), nonché la proteina specifica U1, U1-70K (Figura 2B, corsia 3). Come previsto, l'anti-Gal3 ha precipitato Gal3 (Figura 2B, corsia 3). Questi componenti (SnRNA U1, proteina U1-70K e Gal3) non sono stati trovati nelle precipitazioni di controllo pre-immunitarie (PI) (Figura 2A, Figura 2B, corsia 2). Rispetto a un NE non esaurito effettuato come controllo positivo (Figura 2C, corsia 1), U1ΔNE non ha mostrato attività di giunzione (Figura 2C, corsia 2). L'attività di splicing nell'U1ΔNE potrebbe essere ricostituita dal complesso snRNP Gal3 - U1 legato al tallone (Figura 2C, corsia 6). Sono stati trovati entrambi i prodotti della reazione di giunzione, esoni ligati e lariat di introne asportato (evidenziati da frecce a destra), nonché intermedi, esone 1 e esone lariat 2. I componenti delle frazioni 3-5 sono stati fondamentali per ripristinare lo splicing a U1ΔNE. Quando le frazioni 3-5 sono state sostituite dal solo tampone (60% D) nell'immunoprecipitazione, non è stato possibile osservare alcuna attività di splicing sulla miscelazione con U1ΔNE (Figura 2C, corsia 2), indicando che le perle anti-Gal3 non erano responsabili del ripristino dell'attività di splicing in quest'ultimo. In modo più persuasivo, quando le frazioni 3-5 sono state sostituite dalla frazione 1 nella procedura di immunoprecipitazione e quindi aggiunte a U1ΔNE, non sono stati trovati intermedi o prodotti della reazione di splicing (Figura 2C, corsia 4). Analisi precedenti avevano documentato che il Gal3 nella frazione 1 rappresentava la proteina Gal3 libera, non in associazione con alcun complesso RNP10 e il northern blotting del materiale immunoprecipitato dalla frazione 1 non è riuscito a rivelare alcun snRNA U116. Infine, gli immunoprecipitati dalla frazione1 e dalle frazioni 3-5 non hanno mostrato attività di splicing quando analizzati in assenza di U1ΔNE (Figura 2C, corsie 3 e 5, rispettivamente).

Figure 2
Figura 2: Risultati rappresentativi delle composizioni di RNA e polipeptidi del precipitato anti-Gal3 della regione 10S del gradiente glicerolo e della sua capacità di ricostituire lo splicing in estratto nucleare impoverito di U1 snRNP (U1ΔNE). (A) Analisi northern blotting di SnRNA U1 legato a perline accoppiate con siero pre-immune (PI; corsia 2) o a perline accoppiate con anti-Gal3 (αGal3; corsia 3). La corsia 1 rappresenta il 20% della quantità di frazioni combinate di gradiente di glicerolo sottoposte a immunoprecipitazione. La corsia 2 e la corsia 3 rappresentano ciascuna il 25% del materiale legato eluito dalle rispettive perle. (B) Analisi western blotting di polipeptidi legati a perline accoppiati con siero preimune (corsia 2) o anti-Gal3 (corsia 3). Le identità proteiche sono indicate sulla destra. La corsia 1 rappresenta il 20% della quantità di frazioni combinate di gradiente di glicerolo sottoposte a immunoprecipitazione. La corsia 2 e la corsia 3 rappresentano ciascuna il 75% del materiale legato eluito dalle rispettive perle. (C) Analisi della capacità di ripristinare l'attività di splicing a U1ΔNE mediante immunoprecipitati anti-Gal3 (αGal3) della frazione gradiente di glicerolo 1 (Fr 1), frazioni 3-5 (Fr 3-5) o 60% Tampone D (60% D). Il segno + o - sopra la linea continua in grassetto indica la presenza o l'assenza di ciascuno di questi precipitati nella miscela di reazione di giunzione. Il segno + o - sotto la linea continua in grassetto indica la presenza o l'assenza di U1ΔNE (o NE nel buffer D). Corsia 1: 4 μL NE in un saggio di giunzione da 12 μL, il 100% dei quali è stato sottoposto ad analisi su gel. Per le corsie 2-6, il volume totale del saggio di giunzione è stato di 24 μL, il 50% dei quali è stato sottoposto ad analisi del gel. Corsia 2: 8 μL U1ΔNE più perline da precipitazioni del 60% D. Corsia 3: perline da precipitazioni di Fr 1. Corsia 4: 8 μL U1ΔNE più perline da precipitazioni di Fr 1. Corsia 5: perline da precipitazioni di Fr 3-5. Corsia 6: 8 μL U1ΔNE più perline da precipitazioni di Fr 3-5. Le posizioni di migrazione del substrato pre-mRNA, degli intermedi e dei prodotti (lariat introne ed esoni legati, evidenziati da frecce) sono indicate a destra. I dati nel pannello C derivano dallo stesso esperimento mostrato nel pannello A, figura 2 di Haudek et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I risultati mostrati nella Figura 2 sono stati ottenuti con anti-Gal3 (#49). Gli stessi risultati potrebbero essere osservati con un altro anti-Gal3 (#24) ma il siero pre-immune del coniglio #49 non è riuscito a ricostituire lo splicing in U1ΔNE dopo l'incubazione con frazioni 3-516. Tutti questi risultati suggeriscono fortemente che il substrato pre-mRNA può legarsi alla particella 10S Gal3 - U1 snRNP immobilizzata su perline e che il complesso ternario è funzionale nella via di splicing.

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Discussion

Questo rapporto fornisce i dettagli sperimentali che documentano un complesso snRNP Gal3 - U1 intrappolato su perline rivestite anti-Gal3 può legarsi al substrato pre-mRNA e questo complesso ternario può ripristinare l'attività di splicing a un NE impoverito di SnRNP U1. Gal3 è un membro di una famiglia di proteine originariamente isolate sulla base della sua attività di legame ai carboidrati specifica del galattosio23 . I primi studi di immunofluorescenza e frazionamento subcellulare hanno fornito l'accenno iniziale di un'associazione di Gal3 con componenti del meccanismo di splicing: colocalizzazione in speckles nucleari con polipeptidi del nucleo sm di snRNPs e la famiglia di fattori di speziatura ricchi di serina e arginina (SR)24,25 e sedimentazione su gradienti di solfato di cesio a densità (1,3-1,35 g/mL) corrispondenti a quelli di hnRNP e snRNP24 . Successivi esperimenti di deplezione-ricostituzione, a loro volta, hanno mostrato che Gal3 (così come un altro membro della famiglia delle galectine, galectina-1 (Gal1)) erano necessari, ma ridondanti, fattori nei saggi di splicing senza cellule7,8.

Quando il NE è frazionato su un gradiente di glicerolo, l'immunoprecipitazione delle frazioni di gradiente con anti-Gal3 ha prodotto complessi distinti con rapporti variabili di diversi snRNA e proteine associate, suggerendo che Gal3 è associato a più snNP in assenza di substrato di splicing pre-mRNA10. In particolare, Gal3 e U1 snRNP sono assemblati in una monoparticella che sedimenta nella regione ~ 10S del gradiente (frazioni 3-5 di un gradiente di glicerolo del 12% -32%). Poiché il legame di U1 snRNP al sito di giunzione 5'-splice del pre-mRNA rappresenta il primo passo nell'assemblaggio dello spliceosoma5,26, è stato possibile che Gal3 possa entrare nella via di splicing attraverso la sua associazione con U1 snRNP. Questa nozione è supportata dall'osservazione che Gal3, come parte del complesso 10S Gal3-U1 snRNP, potrebbe essere trovato per associarsi a un substrato pre-mRNA ma non con RNA di controllo privo di siti di giunzione, suggerendo che il riconoscimento del sito di giunzione 5 '-splice da parte di U1 snRNP era un requisito chiave nel suo assemblaggio in uno spliceosoma. Inoltre, il pretrattamento delle frazioni contenenti la particella Gal3-U1 snRNP con nucleasi micrococcica ha abolito il carico di Gal3 sul pre-mRNA10. La domanda chiave, quindi, è se questo complesso ternario precoce, costituito da Gal3, U1 snRNP e pre-mRNA, rappresenti un complesso funzionale E impegnato nella via di splicing o un complesso H senza uscita che non può entrare nella via di splicing5,26. Abbiamo affrontato questa domanda testando se il Gal3 - U1 snRNP può ricostituire l'attività di splicing in NE impoverito di U1 snRNP con concomitante perdita di capacità di splicing (U1ΔNE). I risultati dei nostri esperimenti, il cui protocollo è dettagliato nel presente articolo, indicano che Gal3 - U1 snRNP si lega al substrato pre-mRNA per formare un complesso E funzionale e che U1 snRNP è necessario per incorporare Gal3 nella via di splicing16.

Due passaggi critici all'interno del protocollo sperimentale descritto devono essere notati. In primo luogo, il passaggio 3.2.7 richiede la rimozione del materiale non legato del surnatante dopo la precipitazione anti-Gal3 delle frazioni di glicerolo. La rimozione completa del liquido dalle perle di agarosio pellettate richiede che la punta dell'ago della siringa Hamilton sia inserita sul fondo delle perline. Questo deve essere fatto con attenzione in modo che le perline non ostruiscano l'ago della siringa o si perdano aderendo all'ago mentre quest'ultimo viene estratto dal tubo. In secondo luogo, è importante che le perle pellettate siano utilizzate per l'assemblaggio delle reazioni di giunzione con il minor ritardo possibile. Il coordinamento di queste due fasi è stato fondamentale per il successo della procedura. A questo proposito, va anche notato che abbiamo recentemente migliorato il recupero dei complessi snRNP Gal3-U1 nella frazione pellet sostituendo le perle della proteina A-Sepharose CL-4B con nanoparticelle magnetiche della proteina A nell'accoppiamento covalente dell'anticorpo anti-Gal3 alle perline.

La conclusione chiave deriva da esperimenti in cui U1ΔNE, privo di attività di splicing, è completato dalla particella 10S Gal3 - U1 snRNP immunoprecipipitata da perline covalentemente derivate con anticorpi anti-Gal3. Sebbene vi fosse una chiara evidenza di rimozione dell'introne, l'efficienza dell'unione degli esoni era inferiore a quella osservata nella reazione condotta in assenza di perline (confrontare la corsia 6 rispetto alla corsia 1 nella Figura 2C). Nei nostri saggi di splicing senza cellule, circa il 30% della radioattività nel substrato pre-mRNA viene tipicamente convertito in esoni legati. Questa carenza nella legatura degli esoni potrebbe essere dovuta a: (a) una quantità non ottimale di un componente critico, sia in U1ΔNE (Figura 1A) che nel complesso Gal3 - U1 snRNP (Figura 1B); o (b) alcuni vincoli strutturali (ad esempio, difficoltà nel subire un cambiamento conformazionale) dello snRNP Gal3 - U1 immobilizzato sulle perle anti-Gal3 durante la reazione di splicing (Figura 1C).

Altri ricercatori hanno riportato l'uso dell'immunoselezione in fase solida per intrappolare complessi specifici e documentare l'attività catalitica o una progressione ordinata delle strutture dello spliceosoma. Ad esempio, Chiu et al. hanno mostrato che l'aggiunta del fattore di splicing del lievito Cwc25 può inseguire il substrato pre-mRNA su uno spliceosoma assemblato intrappolato in anticorpi nella prima reazione catalitica, producendo gli intermedi, l'esone 1 e il lariat-esone227. Nello stesso sistema di lieviti, Krishnan et al. hanno utilizzato un tag A proteico per immobilizzare, tramite IgG biotinilato, il complesso di spliceosomi Bact purificato in perline magnetiche rivestite di streptavidina in uno studio biofisico sul rimodellamento pre-mRNA (distanza tra il sito di giunzione 5'-splice e il punto di diramazione) prima della prima fase di splicing28. Il nostro presente articolo estende questi studi precedenti in termini di completamento di entrambe le fasi della reazione di splicing e, quindi, può avere un significato di natura tecnica: questo stesso insieme di procedure potrebbe essere applicato a un numero qualsiasi di altri fattori di splicing che si associano agli snNP per esaminare quando e come questi fattori si caricano sui complessi spliceosomiali. La capacità di monitorare la formazione di prodotti mRNA dalla reazione di splicing costituisce una forte evidenza che questi spliceosomi assemblati sono effettivamente funzionali. Ciò potrebbe favorire la nostra comprensione di come si formano gli spliceosomi, poiché i rapporti precedenti che utilizzano approcci proteomici17 catalogano solo la presenza di alcuni fattori in un dato complesso piuttosto che come i fattori potrebbero essere stati caricati sul complesso.

Una chiara limitazione dell'applicabilità generale di queste procedure ad altre proteine o snRP per valutare il loro ruolo nello splicing è la disponibilità di un anticorpo specifico diretto contro il particolare fattore che precipiterà efficacemente il suo complesso associato. Ad esempio, gli antisieri policlonali anti-Gal3 di un certo numero di conigli (ad esempio, #24, #49) hanno immunoprecipitato il complesso Gal3-U1 snRNP da estratto nucleare o frazioni di glicerolo 3-5 (U1 snRNA e proteina U1 70K co-precipitati con l'antigene affine, Gal3). Al contrario, due anticorpi monoclonali disponibili in commercio diretti contro Gal3, Mac-2 e NCL-GAL3, non sono riusciti a produrre gli stessi risultati. Gli epitopi di Mac-2 e NCL-GAL3 sono stati mappati al dominio ammino-terminale del polipeptide Gal329 ed è possibile che i rispettivi epitopi non siano accessibili nel complesso Gal3-U1 snRNP. Inoltre, un fattore legato agli anticorpi (ad esempio, Gal3) e il suo complesso associato (ad esempio, U1 snRNP) potrebbero non essere più in grado di formare ulteriori interazioni con il pre-mRNA o altri componenti spliceosomiali. Ciò può essere dovuto all'interferenza fisica dell'anticorpo o della matrice a cui l'anticorpo è accoppiato covalentemente. Pertanto, ogni sistema di interesse deve essere valutato caso per caso. Nonostante queste limitazioni, tuttavia, sembra che lo schema di utilizzo di complessi affinati o immunoselezionati su perline per ricostituire l'attività di splicing in estratti impoveriti di uno specifico fattore di splicing possa essere generalmente applicabile ad altri sistemi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dalla National Science Foundation Grant MCB-0092919 e dalla Michigan State University Intramural Research Grant 09-CDFP-2001 (a RJP) e dal National Institutes of Health Grant GM-38740 e dal Michigan AgBioResearch Project MICL02455 (a JLW).

Il substrato pre-mRNA MINX utilizzato nei saggi di giunzione è stato un gentile dono della dott.ssa Susan Berget (Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-U1 snRNP The Binding Site Hu ENA-RNP #33471 human autoimmune serum specific for U1 snRNP
bottle top vacuum filter Fisher Scientific Corning 431153 (0.22 μm; PES 150 ml) for filtering solutions containing Tris
centrifuge International Equipment Company IEC Model PR-6 for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation
diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich 159220-5G for treatment of water used in preparation of all solutions
dimethylpimelimidate (DMP) Sigma-Aldrich 80490-5G for cross-linking antibody to Sepharose beads
electrophoresis cell BioRad Laboratories, Inc Mini-Protean II for SDS-PAGE separation of proteins
ethanolamine Sigma-Aldrich 411000-100ml for blocking after the cross-linking reaction
gel electrophoresis system Hoefer, Inc HSI SE 500 Series for separating snRNAs by gel electrophoresis
gel slab dryer BioRad Model 224 for drying gel slabs for autoradiography
Hybond ECL membrane GE Healthcare RPN3032D (0.2 μm; 30 cm x 3 m) for immunoblotting of proteins on membrane
microdialyzer (12 x 100 μl sample capacity) Pierce Microdialyzer System 100 for exchanging the buffer of nuclear extract  
microdialyzer membranes (8K cutoff) Pierce 66310 for exchanging the buffer of nuclear extract 
non-fat dry milk Spartan Stores Spartan Instant Non-fat Dry Milk
Protein A Sepharose CL-4B Millipore-Sigma GE 17-0780-01 for coupling antibody to beads
Proteinase K Millipore-Sigma P2308-5mg for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs
RNasin Promega N2111 for inhibiting ribonuclease activity
rocker/rotator Lab Industries, Inc  Labquake Shaker 400-110 for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation
Safety-Solve Research Products International Corp. No. 111177 scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate
scintillation counter Beckman Instruments LS6000SC scintillation counter for determination of radioactivity 
speed vaccum concentrator Savant SVC 100H for drying ethanol-precipitated RNA pellets
Transphor electrophoresis unit Hoefer, Inc Hoefer TE Series Transphor for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane

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References

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Voss, P. G., Haudek, K. C., Patterson, R. J., Wang, J. L. Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads. J. Vis. Exp. (166), e61990, doi:10.3791/61990 (2020).

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