إعادة برمجة مباشرة من الخلايا الليفية البشرية في Myoblasts للتحقيق في العلاجات للاضطرابات العصبية العضلية
Summary
يصف هذا البروتوكول تحويل الخلايا الليفية الجلدية إلى خلايا myoblasts وتمايزها إلى ميوتوب. وتستمد خطوط الخلية من المرضى الذين يعانون من اضطرابات عصبية عضلية ويمكن استخدامها للتحقيق في الآليات المرضية واختبار الاستراتيجيات العلاجية.
Abstract
وقد أعاقت التحقيقات في كل من علم الفيزيولوجيا المرضية والأهداف العلاجية في dystrophies العضلات القدرة التكاثرية المحدودة من myoblasts الإنسان. وقد تم إنشاء عدة نماذج الماوس لكنها إما لا تمثل حقا فيزيولوجيا المرض البشري أو لا تمثل الطيف الواسع من الطفرات الموجودة في البشر. تخليد myoblasts الإنسان الأساسي هو بديل لهذا القيد; ومع ذلك، فإنه لا يزال يعتمد على خزعات العضلات، والتي هي الغازية وليس من السهل المتاحة. في المقابل، خزعات الجلد هي أسهل للحصول على وأقل الغازية للمرضى. يمكن تخليد الخلايا الليفية المشتقة من خزعات الجلد وتمايزها في الخلايا العضلية ، مما يوفر مصدرًا للخلايا ذات الإمكانات الميوجينية الممتازة. هنا ، ونحن وصف سريع وطريقة إعادة برمجة مباشرة من الخلايا الليفية في النسب ميوجيني. يتم نقل الخلايا الليفية مع اثنين من الفيروسات العدسية: hTERT لتخليد الثقافة الأولية و MYODtet-inducible ، والتي عند إضافة doxycycline ، تحفز على تحويل الخلايا الليفية إلى myoblasts ثم تنضج myotubes ، والتي تعبر عن علامات التمايز المتأخر. يمثل هذا البروتوكول السريع للتمايز أداة قوية للتحقيق في الآليات المرضية والتحقيق في العلاجات الحيوية المبتكرة المستندة إلى الجينات أو الأدوية للاضطرابات العصبية العضلية.
Introduction
النماذج الخلوية التي تم الحصول عليها مباشرة من الأنسجة البشرية مفيدة في نمين العديد من الاضطرابات الوراثية البشرية ، مع ميزة وجود السياق الجيني الأصلي ، وفي كثير من الحالات ، استنساخ نفس السمات الجزيئية والخلوية التي لوحظت في المرضى. في مجال الاضطرابات العصبية العضلية ، كانت خزعات العضلات مصدرًا كبيرًا للعضات العضلية البشرية وساعدت في توضيح الآليات المرضية. بالإضافة إلى ذلك، فهي أداة هامة لاختبار في الجسم الحي من الأدوية والعلاجات الجينية. من ناحية ، اشتقاق myoblasts من شظايا العضلات من السهل نسبيا. من ناحية أخرى ، فإن ثقافة وصيانة myoblasts الأولية هي صعبة ، وذلك بسبب معدل انتشارها المحدود وssescence تكرار في المختبر1. بديل لهذه القيود هو تخليد myoblasts مع إدخال التيلوميراز البشري(hTERT)و / أو كيناز cyclin تعتمد 4(CDK4)الجينات2,3, مع الحفاظ على ملامح العضلات الهيكل العظمى4. ومع ذلك ، فإن منبع myoblasts الأولية لا يزال يعتمد على خزعة العضلات ، وهو إجراء جراحي مع مساوئ للمرضى ، والتي ، في كثير من الحالات ، وعضلاتها في انحطاط المتقدمة. وهكذا، والعضلات من هؤلاء المرضى يتكون من نسبة كبيرة من الأنسجة الدهنية وتليفي و/ أو، وغلة خلايا العضلات أقل، مما يتطلب تنقية الخلايا سابقا إلى تخليد.
على النقيض من خزعات العضلات ، فإن خزعات الجلد أكثر سهولة وأقل ضررًا للمرضى. يمكن أن تستمد الخلايا الليفية الأولية من شظايا الجلد في المختبر. على الرغم من أن الخلايا الليفية لا تتأثر في المقام الأول بالطفرات التي تسبب اضطرابات عصبية عضلية ، إلا أنه يمكن تقسيمها إلى myoblasts. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق إدراج جين Myod، وهو عامل نسخ تنظيمي5. في هذه المخطوطة، نحن وصف بروتوكول للحصول على myoblasts عبر مختلفة، من إنشاء الثقافات الخلايا الليفية إلى منبرات myotubes مختلفة (يتم وصف ملخص تمثيلي للأسلوب في الشكل 1).
ويعتمد الاختبار السريري قبل السريري للاستراتيجيات العلاجية على النماذج الخلوية والحيوانية التي تحمل طفرات مماثلة للطفرات الموجودة في المرضى البشريين. على الرغم من أن تطوير النماذج الحيوانية أصبح أكثر جدوى مع تقدم تقنيات تحرير الجينات مثل CRISPR/Cas96، إلا أنه لا يزال صعبًا ومكلفًا. وهكذا، فإن خطوط الخلايا المشتقة من المريض هي خيار يمكن الوصول إليه للحصول على نماذج، تغطي الطيف الكبير من طفرات المرض مثل ضمور العضلات دوشين (DMD). إن عنتع وإنشاء نماذج الخلايا أمران حاسمان لتطوير العلاجات الشخصية لمثل هذه الأمراض.
بين العلاجات الشخصية التي تم التحقيق فيها، exon تخطي الاستراتيجيات هي واحدة من تلك الواعدة لdystrophies العضلات المختلفة7،8. تتكون هذه الاستراتيجية من إنتاج بروتين أقصر ولكن وظيفية. يتم تنفيذ هذا عن طريق إخفاء تعريف exon إلى الجُزَم ، وبالتالي استبعاد إكسون المتحول من الرسول النهائي. هذه هي التكنولوجيا الواعدة جدا التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير لDD. وهكذا، فإننا أيضا وصف في هذا البروتوكول، وأساليب لعابنة الأجهزة myoblasts مع اثنين من خارج مختلفة تخطي التكنولوجيات ذات الصلة: oligonucleotides المضادة للانكارين (AON) و U7snRNA-أدينو المرتبطة بالفيروس (AAV). AON transfection هو أداة جيدة للفحص الأولي لعدة تسلسلات تهدف إلى تعزيز exon تخطي9. ومع ذلك، فإن نشاط الـ AONs عابر. للحصول على تعبير مستمر من تسلسل antisenses، ونحن أيضا استكشاف RNAs النووية الصغيرة (snRNAs) جنبا إلى جنب مع AAV، والسماح توطين النووية وإدراجها في آلية الربط10. U7 هو سنرنا تشارك في معالجة المرنا المرنا الحجر البشري التي يمكن هندستها لربط البروتينات التي سوف تعيد توجيهها إلى spliceosome وتقديم تسلسل antisense11. استخدام تعديل U7 snRNAs في تركيبة مع ناقلات AAV يتغلب على القيود المفروضة على AONs مما أدى إلى استمرار التعبير عن AONs وأفضل نقل الأنسجة ذات الأهمية12. نحن نستخدم الخلايا المستمدة من مرضى DMD لهذا البروتوكول لتوضيح استراتيجية تخطي exon.
Protocol
Representative Results
Discussion
للحصول على خطوط خلايا FM ذات نوعية جيدة، تكون بعض الخطوات حاسمة. وكلما أسرعت عملية خزعة الجلد، كلما كانت فرص الحصول على الخلايا الليفية الصحية أكبر. عدد مرور الثقافات الخلايا الليفية مهم أيضا. الخلايا الأولية لديها قدرة انتشارية محدودة وبعد العديد من الممرات ، تدخل في شيخوخة تكرارية. وبالت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر الدكتور فنسنت مولي على مشاركته معرفته في الماضي بشأن النموذج. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (R01 NS043264 (K.M.F., وR.B.W.) ، والمعهد الوطني للصحة في الولايات المتحدة من التهاب المفاصل والأمراض العضلية الهيكلية والجلدية (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M. ، R.N., وN.W.). تلقت N.W. دعم الزمالة من جامعة ولاية أوهايو / مجموعة العضلات مستشفى الأطفال على الصعيد الوطني ومؤسسة فيليب. وقد تم دعم هذا العمل أيضا من قبل صناديق تقديرية داخلية وجزء من exon 2 تخطي العمل وقد تم أيضا بدعم من قبل CureDuchenne (K.M.F.) ورابطة Francaise Contre ليه Myopathies. رقم IRB: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 وIBBCSC#: IBS00000123.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
References
- Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).
- Pantic, B., et al. Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts. Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).
- Thorley, M., et al. Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines. Skeletal Muscle. 6 (1), 43 (2016).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen. Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy. Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).
- Hwang, J., Yokota, T. Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies. Expert reviews in molecular medicine. 21, 5 (2019).
- Wein, N., et al. Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).
- De Angelis, F. G., et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).
- Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).
- Wein, N., et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).
- Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene. Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Developmental Biology. 265 (2), 294-301 (2004).
