Summary

Reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares

Published: April 03, 2021
doi:

Summary

Este protocolo describe la conversión de fibroblastos de piel en mioblastos y su diferenciación en miotubes. Las líneas celulares se derivan de pacientes con trastornos neuromusculares y se pueden utilizar para investigar mecanismos patológicos y para probar estrategias terapéuticas.

Abstract

Las investigaciones sobre la fisiopatología y las dianas terapéuticas en distrofias musculares se han visto obstaculizadas por la limitada capacidad proliferativa de los mioblastos humanos. Se han creado varios modelos de ratón, pero no representan realmente la fisiopatología humana de la enfermedad o no son representativos del amplio espectro de mutaciones que se encuentran en los seres humanos. La inmortalización de los mioblastos primarios humanos es una alternativa a esta limitación; sin embargo, todavía depende de biopsias musculares, que son invasivas y no fácilmente disponibles. Por el contrario, las biopsias cutáneas son más fáciles de obtener y menos invasivas para los pacientes. Los fibroblastos derivados de biopsias de piel pueden ser inmortalizados y transdiferenciados en mioblastos, proporcionando una fuente de células con un excelente potencial miogénico. Aquí, describimos un método de reprogramación rápida y directa de fibroblasto en un linaje miogénico. Los fibroblastos se transducen con dos lentivirus: hTERT para inmortalizar el cultivo primario y un MYODinducible en tet, que tras la adición de doxiciclina, induce la conversión de fibroblastos en mioblastos y luego miotubes maduros, que expresan marcadores de diferenciación tardía. Este protocolo de transdiferenciación rápida representa una poderosa herramienta para investigar mecanismos patológicos e investigar bioterapias innovadoras basadas en genes o farmacológicas para trastornos neuromusculares.

Introduction

Los modelos celulares obtenidos directamente de los tejidos humanos son útiles para modelar muchos trastornos genéticos humanos, con la ventaja de tener el contexto genómico original y, en muchos casos, reproducir las mismas señas de identidad moleculares y celulares observadas en los pacientes. En el campo de los trastornos neuromusculares, biopsias musculares han sido una gran fuente de mioblastos humanos y han ayudado en la elucidación de mecanismos patológicos. Además, son una herramienta importante para las pruebas in vivo de fármacos y terapias génicas. Por un lado, la derivación de mioblastos de fragmentos musculares es relativamente fácil. Por otro lado, la cultura y el mantenimiento de los mioblastos primarios son difíciles, debido a su limitada tasa de proliferación y senescencia replicativa in vitro1. Una alternativa para estas limitaciones es inmortalizar los mioblastos con la inserción de los genes telomerasa humana(hTERT)y/o quinasa 4(CDK4)dependientes de la ciclina2,3,con preservación de las características musculares esqueléticas4. Sin embargo, la obtensión de los mioblastos primarios sigue dependiendo de la biopsia muscular, un procedimiento quirúrgico con desventajas para los pacientes, que, en muchos casos, tienen sus músculos en degeneración avanzada. Así, el músculo de estos pacientes se compone de una proporción significativa de tejido fibromático y/o adiposo y produce menos células musculares, requiriendo la purificación de las células previamente a la inmortalización.

A diferencia de las biopsias musculares, las biopsias de la piel son más accesibles y son menos dañinas para los pacientes. Los fibroblastos primarios se pueden derivar de fragmentos de piel in vitro. Aunque los fibroblastos no se ven afectados principalmente por mutaciones que causan trastornos neuromusculares, pueden ser transdiferenciados en mioblastos. Esto se puede lograr mediante la inserción del gen Myod, un factor de transcripción regulador miogénico5. En este manuscrito, describimos el protocolo para obtener mioblastos transdiferenciados, desde el establecimiento de cultivos de fibroblastos hasta la obtensión de miotubes diferenciados (se representa un resumen representativo del método en la Figura 1).

Las pruebas preclínicos de estrategias terapéuticas dependen de modelos celulares y animales portadores de mutaciones similares a las mutaciones encontradas en pacientes humanos. Aunque el desarrollo de modelos animales se ha vuelto más factible con el avance de tecnologías de edición genética como CRISPR/Cas96,sigue siendo desafiante y costoso. Por lo tanto, las líneas celulares derivadas del paciente son una opción accesible para tener modelos, cubriendo el gran espectro de mutaciones de enfermedades como la distrofia muscular de Duchenne (DMD). La obtención y la creación de modelos celulares son cruciales para el desarrollo de terapias personalizadas para este tipo de patologías.

Entre las terapias personalizadas que se han investigado, las estrategias de salto exon es una de las prometedoras para diferentes distrofias musculares7,8. Esta estrategia consiste en producir una proteína más corta pero funcional. Esto se realiza ocultando la definición exon al empalme, excluyendo así el exon mutado del mensajero final. Esta es una tecnología muy prometedora que ha sido aprobada por la FDA para dmd. Así, también describimos en este protocolo, métodos para transfectar mioblasts con dos exon diferentes saltando tecnologías relacionadas: oligonucleótidos antisense (AON) y virus asociados al U7snRNA-adeno (AAV). La transfección AON es una buena herramienta para la proyección inicial de varias secuencias diseñadas para promover el salto exon9. Sin embargo, la actividad de los AON es transitoria. Para obtener una expresión sostenida de secuencias antisense, también exploramos pequeñas ANR nucleares (SNRNAs) combinadas con AAV, permitiendo la localización e inclusión nuclear en la maquinaria de empalme10. U7 es un snRNA implicado en el procesamiento de ARNm de histona que se puede diseñar para unir proteínas que lo redirigirán al empalme y entregarán secuencias antisense11. El uso de SNRNAs U7 modificados en combinación con vectores AAV supera las limitaciones de los AONs, lo que resulta en una expresión continua de los ANV y una mejor transducción de tejidos de interés12. Utilizamos células derivadas de pacientes con DMD para este protocolo para ilustrar la estrategia de salto exon.

Protocol

Todos los experimentos y biopsias se llevaron a cabo siguiendo las reglas éticas de las instituciones involucradas bajo la aprobación de la Junta Nacional de Revisión Institucional del Hospital de Niños. 1. Inicio del cultivo de fibroblastos dérmicos Establecimiento del cultivo de fibroblastos Aliquot 10 mL de medio fibroblasto(Tabla 1)en tubos cónicos de 15 ml. La biopsia de la piel debe colocarse y transportarse en este medio. La biopsia se puede alma…

Representative Results

Este protocolo muestra cómo establecer cultivos de fibroblastos derivados de la piel humana y convertirlos en mioblastos y luego en miotubes diferenciados. Este tipo de línea celular es extremadamente útil para el estudio de trastornos neuromusculares y pruebas in vitro de terapias potenciales. Se muestra una representación esquemática de la conversión fibroblasta en la figura 1. La Figura 2A muestra un fragmento de pie…

Discussion

Para obtener líneas celulares FM con buena calidad, algunos pasos son críticos. Cuanto antes se procese la biopsia de la piel, mayores serán las posibilidades de obtener fibroblastos sanos. El número de pasajes de cultivos de fibroblastos también es importante. Las células primarias tienen una capacidad proliferativa limitada y después de muchos pasajes, entran en senescencia replicativa. Por lo tanto, es mejor tener un stock de fibroblastos en un número de paso bajo y transformar las células en el paso más tem…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría dar las gracias al Dr. Vincent Mouly por compartir sus conocimientos en el pasado con respecto al modelo. Este trabajo ha sido apoyado por el Instituto Nacional de Salud del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares de los Estados Unidos (R01 NS043264 (K.M.F., y R.B.W.)), el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticos y cutáneas (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., y N.W.). N.W. ha recibido apoyo de becas de la Universidad Estatal de Ohio/Nationwide Children’s Hospital Muscle Group y la Fundación Philippe. Este trabajo también fue apoyado por fondos discrecionales internos y parte de la obra de salto exon 2 ha sido apoyada también por CureDuchenne (K.M.F.) y la Asociación Francaise Contre Les Myopathies. Número IRB: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 e IBCSC#: IBS000000123.

Materials

100 mm dish Corning 430167
0.25% Trypsin-EDTA, phenol red Thermo Fisher 2500056
10X Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP3994
12-well plate Corning 3513
20X Transfer buffer Thermo Fisher NP00061
20X Tris-acetate SDS running buffer Thermo Fisher LA0041
3-8% Tris-Acetate gel Thermo Fisher EA0378BOX
75 cm2 flask Corning 430641U
Antibiotic-Antimicotic 100X Thermo Fisher 15240062
Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody Developmental Studies Hybridome Bank MF20 supernatant Dilution 1:50
Antioxidant Thermo Fisher NP0005
BCA Protein Assay Thermo Fisher 23227
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
DAPI Thermo Fisher D3571 Dilution 1:1000
Digitonin Millipore Sigma 300410250MG
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2438
DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate Thermo Fisher 10569044
DNAse I set (250U) Zymo Research Corporation E1010
Doxycycline Hydrochloride Fisher Scientific BP2653-5
Dup2 human primers Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG
TTTCTC 3'
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC
CTGT 3'
Dystrophin antibody Abcam ab15277 Dilution 1:200
Fetal bovine serum Thermo Fisher 16000
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A11001 Dilution 1:1000
Halt Protease inhibitor cocktail 100X Thermo Fisher 78430
Hemocytometer Hausser Scientific 3100
Hygromycin B Thermo Fisher 10687010
IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) Li-Cor 926-68071 Dilution 1:5000
Lab-Tek II CC2 chamber slide system Thermo Fisher 15852
Laemmli Bioworld 105700201
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher L3000008
Matrigel GFR membrane matrix Corning 354230
Methanol Fisher Scientific A412P-4
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher 51000001
Nitrocellulose membrane 0.45 µm GE Healthcare Life Sciences 10600002
Normal Goat serum control Thermo Fisher 10000C
Odyssey Blocking Buffer (PBS) Li-Cor 927-40003 Blocking buffer for Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher 11058021
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PCR master mix Thermo Fisher K0172
Phosphatase inhibitor Thermo Fisher A32957
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio Rad 1610374
Puromycin Thermo Fisher A1113803
Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization Li-Cor 926-11021
RevertAid kit Thermo Fisher K1691
RNA Clean & Concentrator-25 Zymo Research Corporation R1018
Scalpels Aspen Surgical 372611
Skeletal Muscle Cell Differentiation medium Promocell C23061
Skeletal Muscle Cell Growth medium Promocell C23060
Triton X-100 Acros Organics 215682500
TRIzol reagent Thermo Fisher 15596026
Tween 20 Fisher Scientific BP337500
Ultra low temperature freezer Thermo Scientific 7402
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020
Vectashield antifade mounting medium Vector Labs H1000

References

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Almeida, C. F., Frair, E. C., Huang, N., Neinast, R., McBride, K. L., Weiss, R. B., Flanigan, K. M., Wein, N. Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders. J. Vis. Exp. (170), e61991, doi:10.3791/61991 (2021).

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