Riprogrammazione diretta dei fibroblasti umani in mioblasti per indagare le terapie per i disturbi neuromuscolari
Summary
Questo protocollo descrive la conversione dei fibroblasti cutanei in mioblasti e la loro differenziazione in miotubi. Le linee cellulari sono derivate da pazienti con disturbi neuromuscolari e possono essere utilizzate per indagare meccanismi patologici e testare strategie terapeutiche.
Abstract
Le indagini sia sulla fisiopatologia che sugli obiettivi terapeutici nelle distrofie muscolari sono state ostacolate dalla limitata capacità proliferativa dei mioblasti umani. Sono stati creati diversi modelli di topi, ma non rappresentano veramente la fisiopatologia umana della malattia o non sono rappresentativi dell’ampio spettro di mutazioni presenti nell’uomo. L’immortalizzazione dei mioblasti primari umani è un’alternativa a questa limitazione; tuttavia, dipende ancora dalle biopsie muscolari, che sono invasive e non facilmente disponibili. Al contrario, le biopsie cutanee sono più facili da ottenere e meno invasive per i pazienti. I fibroblasti derivati dalle biopsie cutanee possono essere immortalati e transdifferenziati in mioblasti, fornendo una fonte di cellule con un eccellente potenziale miogenico. Qui descriviamo un metodo di riprogrammazione rapido e diretto del fibroblasto in un lignaggio miogenico. I fibroblasti vengono trasdotti con due lentivirus: hTERT per immortalare la coltura primaria e un MYODtet-inducibile , che con l’aggiunta di doxiciclina, induce la conversione dei fibroblasti in mioblasti e poi miotubi maturi, che esprimono marcatori di differenziazione tardiva. Questo protocollo di transdifferenziazione rapida rappresenta un potente strumento per indagare i meccanismi patologici e studiare bioterapie innovative a base genica o farmacologica per disturbi neuromuscolari.
Introduction
I modelli cellulari ottenuti direttamente dai tessuti umani sono utili per modellare molti disturbi genetici umani, con il vantaggio di avere il contesto genomico originale e, in molti casi, riprodurre gli stessi tratti distintivi molecolari e cellulari osservati nei pazienti. Nel campo dei disturbi neuromuscolari, le biopsie muscolari sono state una grande fonte di mioblasti umani e hanno contribuito alla spiegazione dei meccanismi patologici. Inoltre, sono uno strumento importante per il test in vivo di farmaci e terapie geniche. Da un lato, la derivazione dei mioblasti dai frammenti muscolari è relativamente facile. D’altra parte, la coltura e il mantenimento dei mioblasti primari sono impegnativi, a causa del loro limitato tasso di proliferazione e della senescenza replicativa in vitro1. Un’alternativa a queste limitazioni è immortalare i mioblasti conl’inserimentodella telomerasi umana (hTERT) e/o della chinasi ciclina-dipendente 4 (CDK4)geni 2,3 , con conservazione delle caratteristiche muscolari scheletriche4. Tuttavia, l’obtenzione dei mioblasti primari dipende ancora dalla biopsia muscolare, una procedura chirurgica con svantaggi per i pazienti, che, in molti casi, hanno i loro muscoli nella degenerazione avanzata. Pertanto, il muscolo di questi pazienti è composto da una proporzione significativa di tessuto fibrotico e / o adiposo e produce meno cellule muscolari, richiedendo la purificazione delle cellule in precedenza per l’immortalizzazione.
A differenza delle biopsie muscolari, le biopsie cutanee sono più accessibili e sono meno dannose per i pazienti. I fibroblasti primari possono essere derivati da frammenti cutanei in vitro. Sebbene i fibroblasti non siano principalmente influenzati da mutazioni che causano disturbi neuromuscolari, possono essere trasifferenti in mioblasti. Questo può essere ottenuto con l’inserimento del gene Myod, un fattore di trascrizione regolatore miogenico5. In questo manoscritto descriviamo il protocollo per ottenere mioblasti transdifferenziati, dalla creazione di colture di fibroblasti all’obtenzione di miotubi differenziati (un riassunto rappresentativo del metodo è raffigurato nella figura 1).
Il test preclinale delle strategie terapeutiche dipende da modelli cellulari e animali che portano mutazioni simili alle mutazioni riscontrate nei pazienti umani. Sebbene lo sviluppo di modelli animali sia diventato più fattibile con il progresso di tecnologie di editing genico come CRISPR/Cas96, è ancora impegnativo e costoso. Pertanto, le linee cellulari derivate dal paziente sono un’opzione accessibile per avere modelli, coprendo l’ampio spettro di mutazioni di malattie come la distrofia muscolare di Duchenne (DMD). L’obtenzione e la creazione di modelli cellulari sono cruciali per lo sviluppo di terapie personalizzate per tali patologie.
Tra le terapie personalizzate che sono state studiate, le strategie di salto dell’esone è una delle promettenti per diverse distrofiemuscolari 7,8. Questa strategia consiste nel produrre una proteina più corta ma funzionale. Questo viene eseguito nascondendo la definizione di esone allo spliceosoma, escludendo quindi l’esone mutato dal messaggero finale. Questa è una tecnologia molto promettente che è stata approvata dalla FDA per dmd. Pertanto, descriviamo anche in questo protocollo, metodi per trasfetto i mioblasti con due diverse tecnologie correlate che saltano l’esone: oligonucleotidi antisense (AON) e virus associato all’U7snRNA-adeno (AAV). La trasfezione AON è un buon strumento per lo screening iniziale di diverse sequenze progettate per promuovere l’esonesaltando 9. Tuttavia, l’attività degli AON è transitoria. Per ottenere un’espressione sostenuta delle sequenze di antisense, abbiamo anche esplorato piccoli RNA nucleari (snRNA) combinati con AAV, consentendo la localizzazione nucleare e l’inclusione nei macchinari di giunzione10. U7 è uno snRNA coinvolto nell’elaborazione dell’mRNA istono che può essere progettato per legare le proteine che lo reindirizzeranno allo spliceosoma e forniranno sequenze di antisense11. L’uso di U7 snRNA modificati in combinazione con vettori AAV supera i limiti delle AON con conseguente continua espressione delle AON e migliore trasduzione dei tessuti di interesse12. Usiamo cellule derivate da pazienti affetti da DMD per questo protocollo per illustrare la strategia di esone-salto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per ottenere linee cellulari FM di buona qualità, alcuni passaggi sono fondamentali. Prima viene elaborata la biopsia cutanea, maggiori sono le probabilità di ottenere fibroblasti sani. Anche il numero di passaggi delle colture di fibroblasti è importante. Le cellule primarie hanno una capacità proliferativa limitata e dopo molti passaggi, entrano in senescenza replicativa. Pertanto, è meglio avere uno stock di fibroblasti a un basso numero di passaggi e trasformare le cellule al primo passaggio possibile.
<p c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dr. Vincent Mouly per aver condiviso le sue conoscenze in passato riguardo al modello. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., e R.B.W.)), il National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., e N.W.). N.W. ha ricevuto il sostegno di borse di studio dall’Ohio State University / Nationwide Children’s Hospital Muscle Group e dalla Philippe Foundation. Questo lavoro è stato sostenuto anche da fondi discrezionali interni e parte del lavoro di salto di exon 2 è stato sostenuto anche da CureDuchenne (K.M.F.) e Association Francaise Contre Les Myopathies. Numero IRB: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 e IBCSC#: IBS00000123.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
References
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