신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍
Summary
이 프로토콜은 근막세포로 피부 섬유아세포의 변환과 근투로의 분화를 설명합니다. 세포주 신경 근육 장애를 가진 환자에서 파생 되 고 병리학 적 메커니즘을 조사 하 고 치료 전략을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
근 이영양증에 있는 병리생리학 그리고 치료 표적 둘 다에 대한 조사는 인간 myoblasts의 제한된 증식 능력에 의해 방해되었습니다. 몇몇 마우스 모형은 만들어졌습니다 그러나 그(것)들은 질병의 인간적인 생리병을 진정으로 대표하지 않거나 인간에서 찾아낸 돌연변이의 넓은 스펙트럼의 대표적이지 않습니다. 인간의 기본 근간이 불멸하는 것은 이 한계에 대한 대안이다. 그러나, 그것은 여전히 근육 생검에 의존, 침략 적이 고 쉽게 사용할 수. 대조적으로, 피부 생검은 환자에게 쉽게 얻고 더 적게 침략적입니다. 피부 생검에서 파생된 섬유아세포는 심근세포로 불멸하고 분화될 수 있으며, 우수한 근생잠재력을 가진 세포의 원천을 제공합니다. 여기서는 섬유아세포의 빠르고 직접적인 리프로그래밍 방법을 근생 계보로 설명합니다. 섬유아세포는 두 개의 렌즈피바이러스로 변환됩니다: hTERT는 1차 문화와 테트 유도할 수 없는 MYOD로,독시사이클린을 첨가하면 섬유아세포를 근막세포로 전환한 다음 후기 분화 마커를 표현하는 성숙근투로 변환합니다. 이 빠른 이차 성전환 프로토콜은 병리학 적 메커니즘을 조사하고 신경 근육 장애에 대한 혁신적인 유전자 기반 또는 약리학적 생물 요법을 조사하는 강력한 도구를 나타냅니다.
Introduction
인간 조직에서 직접 얻은 세포 모델은 원래 게놈 컨텍스트를 갖는 이점과 환자에서 관찰 된 동일한 분자 및 세포 특징을 재현하는 이점으로 많은 인간 유전 질환을 모델링하는 데 유용합니다. 신경 근육 장애의 분야에서, 근육 생검은 인간의 myoblasts의 훌륭한 소스 되었습니다 및 병리학 적 메커니즘의 해명에 도움이 되었습니다. 추가적으로, 그(것)들은 약과 유전자 치료의 생체 내 시험을 위한 중요한 공구입니다. 한편으로는 근육 파편에서 근막의 파생은 비교적 쉽습니다. 한편, 1차 근막의 문화와 유지보수는 시험관 1에서의 제한된 증식율과 복제적 노화로 인해 도전적이다. 이러한 한계에 대한 대안은 인간 텔로머라아제(hTERT) 및/또는사이클린 의존키나아제 4(CDK4)유전자2,3의삽입으로 근막을 불멸시키는 것이며, 골격근의 보존과 함께4. 그럼에도 불구 하 고, 기본 myoblasts의 집착은 여전히 근육 생검에 의존, 환자에 게 단점과 외과 수술, 많은 경우에, 고급 변성에 그들의 근육을 가지고. 따라서, 이들 환자의 근육은 섬유성 및/또는 지방 조직의 상당한 비율로 구성되며, 더 적은 근육 세포를 산출하며, 이전에 세포의 정제를 불멸으로 요구한다.
근육 생검과는 달리 피부 생검은 더 접근가능하며 환자에게 덜 해롭습니다. 1 차적인 섬유아세포는 체외에서피부 단편에서 파생될 수 있습니다. 섬유아세포는 신경 근육 장애를 일으키는 돌연변이에 의해 1차적으로 영향을 받지 않더라도, 근막으로 분화될 수 있습니다. 이는 근생 조절인인 5의 Myod 유전자의 삽입에 의해 달성될수 있다. 본 원고에서, 우리는 섬유아세포 배양의 확립에서 차별화된 근로튜브의 고독에 이르기까지, 변형된 근사를 얻기 위한 프로토콜을 설명한다(방법의 대표적인 요약은 도 1에묘사된다).
치료 전략의 전 임상 테스트는 인간 환자에서 발견되는 돌연변이와 유사한 돌연변이를 운반하는 세포 및 동물 모델에 의존합니다. CRISPR/Cas96과같은 유전자 편집 기술의 발전과 함께 동물 모델의 개발이 더욱 실현 가능해졌지만 여전히 도전적이고 비용이 많이 듭니다. 따라서, 환자 유래 세포주들은 Duchenne 근 이영양증(DMD)과 같은 질병의 돌연변이의 큰 스펙트럼을 커버하는 모형을 갖기 위하여 접근할 수 있는 선택권입니다. 세포 모형의 obtention 그리고 창조는 그 같은 병리를 위한 개인화한 치료의 발달에 중요합니다.
조사 된 개인화 된 치료 중, exon 건너 뛰기 전략은 다른 근 이영양증에 대한 유망한 치료법 중 하나입니다7,8. 이 전략은 짧지만 기능적인 단백질을 생산하는 것으로 구성됩니다. 이것은 스플리케솜에 엑슨 정의를 숨기기 하여 수행되므로 최종 메신저에서 돌연변이된 엑온을 제외합니다. 이것은 DMD에 대 한 FDA에 의해 승인 된 매우 유망한 기술. 따라서, 우리는 또한 이 프로토콜에서 기술, 2개의 다른 엑슨 건너뛰기 관련 기술로 myoblasts를 transfect하는 방법: 안티센스 올리고뉴클레오티드 (AON) 및 U7snRNA-아데노 관련 바이러스 (AAV). AON 트랜스펙트(AON transfection)는 9를 건너뛰는 엑슨을 촉진하기 위해 고안된 여러 시퀀스의 초기 스크리닝을 위한 좋은도구이다. 그러나 AO의 활동은 일시적입니다. 안티센스 서열의 지속적인 발현을 얻기 위해, 우리는 또한 AAV와 결합된 작은 핵 RNA(snRNAs)를 탐구하여 접합 기계10에핵 국소화 및 포함을 허용했습니다. U7은 휘장모가반사시퀀스(11)로리디렉션하고 안티센스 서열을 전달하는 단백질을 결합하도록 설계될 수 있는 히스톤 mRNA의 처리에 관여하는 snRNA이다. AAV 벡터와 함께 수정된 U7 snRNA를 사용하면 AON의 한계를 극복하고 AON의 지속적인 발현과 관심 있는 조직의 더 나은트랜스듀션(12)을생성한다. 우리는 엑슨 건너뛰기 전략을 설명하기 위하여 이 프로토콜을 위해 DMD 환자에게서 파생된 세포를 이용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
좋은 품질의 FM 셀라인을 얻으려면 몇 가지 단계가 중요합니다. 피부 생검이 빨리 처리될수록 건강한 섬유아세포를 얻을 확률이 높아집니다. 섬유아세포 배양의 통과 수도 중요하다. 1 차 세포는 증식 능력이 제한되어 있으며 많은 구절 후에 복제 노화로 들어갑니다. 따라서, 낮은 통로 수에 섬유아세포의 재고를 가지고 가능한 한 초기 통로에서 세포를 변환하는 것이 좋습니다.
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 모델에 대한 과거에 자신의 지식을 공유 빈센트 Mouly 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립 보건국국립신경장애및뇌졸중연구소(R01 NS043264(K01 NS043264,K.M.F.에 의해 지원되고 있다. 및 R.B.W.)), 미국 국립 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소 (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M.M, R.N.및 N.W.). N.W.는 오하이오 주립 대학 / 전국 아동 병원 근육 그룹과 필립 재단으로부터 펠로우십 지원을 받았습니다. 이 작품은 또한 내부 임의 기금에 의해 지원되었으며, exon 2 건너 뛰기 작업의 일부는 CureDuchenne (K.M.F.) 및 협회 Francaise Contre 레 Myopathies에 의해 지원되었습니다. IRB 번호: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 및 IBCSC#: IBS00000123.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
References
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