将人类成纤维细胞直接重新编程到肌细胞中，以研究神经肌肉疾病的治疗方法
Summary
此协议描述了皮肤成纤维细胞转化为肌细胞及其分化成肌管。细胞系来自神经肌肉疾病患者，可用于研究病理机制和测试治疗策略。
Abstract
对肌肉营养不良症的病理生理学和治疗靶点的调查都因人类肌细胞的增殖能力有限而受阻。已经创建了几个小鼠模型，但它们要么不能真正代表人类对这种疾病的生理病理学，要么不能代表人类中发现的广泛突变。人类原发性肌瘤的永生是这一局限性的一种替代：然而，它仍然依赖于肌肉活检，这是侵入性的，不容易获得。相比之下，皮肤活检更容易获得，对患者的侵入性更小。从皮肤活检中提取的纤维细胞可以永生并转导成肌细胞，提供具有极高肌原潜力的细胞来源。在这里，我们描述了一个快速和直接的重新编程方法的成纤维细胞成致远的血统。纤维细胞被两种扁豆病毒所传递 ：hTERT 使原始文化永生，以及一种可诱导的 MYOD，在添加多氧环素后，诱导成纤维细胞转化为肌细胞，然后成熟肌管，表达后期分化标记。这种快速的异位治疗方案是研究病理机制和研究神经肌肉疾病的创新基因或药理生物疗法的有力工具。
Introduction
直接从人体组织获得的细胞模型有助于模拟许多人类遗传性疾病，其优点是具有原始的基因组背景，并在许多情况下复制患者观察到的相同分子和细胞特征。在神经肌肉疾病领域，肌肉活检一直是人类肌细胞的一大来源，有助于阐明病理机制。此外，它们是药物和基因疗法体内测试的重要工具。一方面，从肌肉碎片中提取肌细胞相对容易。另一方面，原发性肌细胞的培养和维持是具有挑战性的，因为它们的增殖率有限，体外1的复制衰老。这些局限性的一个替代方案是，通过插入人类端粒酶（hTERT）和/或环素依赖激酶4（CDK4）基因2，3，保持骨骼肌肉特征4，使肌细胞永生。然而，原发性肌细胞的衰减仍然依赖于肌肉活检，这是一种对患者不利的外科手术，在许多情况下，患者的肌肉处于晚期退化。因此，这些患者的肌肉由相当一部分纤维化和/或脂肪组织组成，产生更少的肌肉细胞，需要净化以前不朽的细胞。
与肌肉活检相比，皮肤活检更容易获得，对患者的危害也较小。原发性成纤维细胞可以从 体外的皮肤碎片中提取。虽然成纤维细胞主要不受导致神经肌肉紊乱的突变的影响，但它们可以转入肌细胞。这可以通过插入Myod基因来实现 ，Myod 基因是一种致幻调节转录因子5。在这份手稿中，我们描述了获得异化肌细胞的协议，从成纤维细胞文化的建立到分化肌管的消减（ 图1中描述了该方法的代表性摘要）。
治疗策略的临床前测试取决于携带类似于人类患者突变的细胞和动物模型。虽然随着CRISPR/Cas96等基因编辑技术的进步，动物模型的发展变得更加可行，但它仍然具有挑战性和代价高昂。因此，患者衍生的细胞系是建立模型的可访问选项，涵盖大量疾病突变，如杜氏肌营养不良症 （DMD）。细胞模型的沉降和创建对于开发针对此类病理的个性化疗法至关重要。
在已调查的个性化疗法中，exon跳过策略是针对不同肌肉萎缩症的有希望的策略之一。此策略包括生产更短但功能性强的蛋白质。这是通过将外来定义隐藏到拼接体中来执行的，因此从最终信使中排除变异的外在定义。这是一个非常有前途的技术，已被FDA批准为DMD。因此，我们还在此协议中描述了用两种不同的外在跳过相关技术来转染肌细胞的方法：抗感寡核苷酸 （AON） 和 U7snRNA-腺相关病毒 （AAV）。AON变性是一个很好的工具，为初步筛选几个序列，旨在促进exon跳过9。但是，AON 的活动是短暂的。为了获得反感序列的持续表达，我们还探索了小型核RNA（snRNA）与AAV相结合，允许核定位和纳入拼接机械10。U7 是参与组蛋白 mRNA 处理的 snRNA，可设计为结合蛋白质，将其重定向到拼接体并提供抗感序列11。使用改性 U7 snRNA 与 AAV 向量相结合，克服了 AON 的局限性，从而继续表达 AON，并更好地传递感兴趣的组织12。我们使用来自DMD患者的细胞来说明免责策略。
Protocol
Representative Results
Discussion
要获得高质量的调频细胞线，某些步骤至关重要。皮肤活检处理得越早，获得健康成纤维细胞的机会就越大。成纤维细胞文化的通过数量也很重要。原细胞的增殖能力有限，经过许多通道后，它们进入复制性衰老。因此，最好在低通道数下储存成纤维细胞，并尽早转化细胞。
另一个重要步骤是病毒生产具有最大的纯度和准确的量化。例如，使用 qPCR 的病毒基因组定量提供了?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢文森特·穆利博士分享他过去对模型的了解。这项工作得到了美国国家卫生研究院国家神经疾病和中风研究所（R01 NS043264（K.M.F.， 和R.B.W.），美国国家卫生研究院国家关节炎和肌肉骨骼和皮肤疾病研究所（NIAMS）（P50 AR070604-01（K.M.F.，K.M，R.N.和N.W.）。N.W.得到了俄亥俄州立大学/全国儿童医院肌肉小组和菲利普基金会的奖学金支持。这项工作也得到了内部自由裁量基金的支持，第2号外逃工作的一部分也得到了CurreDuchenne（K.M.F.）和弗朗西丝·孔特雷·莱斯·米奥帕蒂斯协会的支持。IRB 编号：IRB #： IRB10-00358/CR00005138 和 IBCSC#：IBS00000123。
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
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