Direkte Umprogrammierung menschlicher Fibroblasten in Myoblasten zur Untersuchung von Therapien für neuromuskuläre Störungen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Umwandlung von Hautfibroblasten in Myoblasten und deren Differenzierung in Myotuben. Die Zelllinien stammen von Patienten mit neuromuskulären Störungen und können zur Untersuchung pathologischer Mechanismen und zur Erprobung therapeutischer Strategien verwendet werden.
Abstract
Untersuchungen sowohl der Pathophysiologie als auch der therapeutischen Ziele bei Muskeldystrophien wurden durch die begrenzte Proliferativfähigkeit menschlicher Myoblasten behindert. Mehrere Mausmodelle wurden erstellt, aber sie stellen entweder nicht wirklich die menschliche Physiopathologie der Krankheit dar oder sind nicht repräsentativ für das breite Spektrum von Mutationen beim Menschen. Die Verewigung menschlicher Primärmyoblasten ist eine Alternative zu dieser Einschränkung; Es ist jedoch immer noch abhängig von Muskelbiopsien, die invasiv und nicht leicht verfügbar sind. Im Gegensatz dazu sind Hautbiopsien leichter zu erhalten und weniger invasiv für Patienten. Fibroblasten, die aus Hautbiopsien gewonnen werden, können verewigt und in Myoblasten transdifferenziert werden, was eine Quelle von Zellen mit ausgezeichnetem myogenem Potenzial bietet. Hier beschreiben wir eine schnelle und direkte Reprogrammierungsmethode von Fibroblasten in eine myogene Abstammung. Fibroblasten werden mit zwei Lentiviren transduziert: hTERT zur Verewigung der Primärkultur und ein tet-induzierbares MYOD, das durch Zugabe von Doxycyclin die Umwandlung von Fibroblasten in Myoblasten induziert und dann reife Myotuben auslöst, die späte Differenzierungsmarker ausdrücken. Dieses schnelle Transdifferenzierungsprotokoll stellt ein leistungsfähiges Werkzeug dar, um pathologische Mechanismen zu untersuchen und innovative genbasierte oder pharmakologische Biotherapien für neuromuskuläre Störungen zu untersuchen.
Introduction
Zelluläre Modelle, die direkt aus menschlichen Geweben gewonnen werden, sind nützlich, um viele menschliche genetische Störungen zu modellieren, mit dem Vorteil, dass der ursprüngliche genomische Kontext besteht und in vielen Fällen die gleichen molekularen und zellulären Merkmale reproduziert werden, die bei den Patienten beobachtet wurden. Im Bereich der neuromuskulären Störungen, Muskelbiopsien haben eine große Quelle für menschliche Myoblasten und haben bei der Aufklärung der pathologischen Mechanismen geholfen. Darüber hinaus sind sie ein wichtiges Werkzeug für In-vivo-Tests von Medikamenten und Gentherapien. Einerseits ist die Ableitung von Myoblasten aus Muskelfragmenten relativ einfach. Auf der anderen Seite sind die Kultur und die Aufrechterhaltung der primären Myoblasten aufgrund ihrer begrenzten Proliferationsrate und replizierbaren Seneszenz in vitro1herausfordernd. Eine Alternative für diese Einschränkungen ist die Verewigung von Myoblasten mit der Einfügung der menschlichen Telomerase (hTERT) und/oder der cyclinabhängigen Kinase 4 (CDK4) Gene2,3, mit Erhaltung der Skelettmuskelmerkmale4. Dennoch ist die Obtention von primären Myoblasten immer noch abhängig von der Muskelbiopsie, einem chirurgischen Eingriff mit Nachteilen für die Patienten, die in vielen Fällen ihre Muskeln in fortgeschrittener Degeneration haben. So besteht der Muskel dieser Patienten aus einem signifikanten Anteil an fibrotischem und/oder fettigem Gewebe und ergibt weniger Muskelzellen, was die Reinigung der Zellen vorher bis zur Verewigung erfordert.
Im Gegensatz zu Muskelbiopsien sind Hautbiopsien leichter zugänglich und weniger schädlich für Patienten. Primäre Fibroblasten können aus Hautfragmenten in vitroabgeleitet werden. Obwohl Fibroblasten nicht in erster Linie von Mutationen betroffen sind, die neuromuskuläre Störungen verursachen, können sie in Myoblasten transdifferenziert werden. Dies kann durch die Einfügung des Myod-Gens erreicht werden, einem myogenen regulatorischen Transkriptionsfaktor5. In diesem Manuskript beschreiben wir das Protokoll zur Erlangung transdifferenzierter Myoblasten, von der Etablierung von Fibroblastenkulturen bis zur Obtention differenzierter Myotubes (eine repräsentative Zusammenfassung der Methode ist in Abbildung 1dargestellt).
Die präklinische Prüfung therapeutischer Strategien hängt von zellulären und tierischen Modellen ab, die Mutationen tragen, die den Mutationen bei menschlichen Patienten ähneln. Obwohl die Entwicklung von Tiermodellen mit dem Fortschritt von Gen-Editing-Technologien wie CRISPR/Cas96machbarer geworden ist, ist sie immer noch anspruchsvoll und kostspielig. Daher sind patientenabgeleitete Zelllinien eine zugängliche Option, um Modelle zu haben, die das große Spektrum von Mutationen von Krankheiten wie Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) abdecken. Die Beobachtung und die Erstellung von Zellmodellen sind entscheidend für die Entwicklung personalisierter Therapien für solche Pathologien.
Unter den personalisierten Therapien, die untersucht wurden, exon Überspringen Strategien ist eine der vielversprechenden für verschiedene Muskeldystrophien7,8. Diese Strategie besteht in der Herstellung eines kürzeren, aber funktionellen Proteins. Dies geschieht, indem die Exon-Definition dem Spliceosomen verborgen wird, also das mutierte Exon vom letzten Boten ausgeschlossen wird. Dies ist eine sehr vielversprechende Technologie, die von der FDA für DMD zugelassen wurde. So beschreiben wir in diesem Protokoll auch Methoden zur Transfektion von Myoblasten mit zwei verschiedenen Exon-Übersprungtechnologien: Antisense-Oligonukleotide (AON) und U7snRNA-adeno-assoziiertes Virus (AAV). AON-Transfektion ist ein gutes Werkzeug für das erste Screening mehrerer Sequenzen, die entwickelt wurden, um exon skipping9zu fördern. Die Aktivität von AONs ist jedoch vorübergehend. Um eine nachhaltige Expression von Antisense-Sequenzen zu erhalten, untersuchten wir auch kleine nukleare RNAs (snRNAs) in Kombination mit AAV, was die nukleare Lokalisierung und Aufnahme in die Spleißmaschinerie10ermöglichte. U7 ist eine snRNA, die an der Verarbeitung von Histon-mRNA beteiligt ist, die entwickelt werden kann, um Proteine zu binden, die sie an das Spliceoom umleiten und Antisense-Sequenzen liefern11. Die Verwendung modifizierter U7-SnRNAs in Kombination mit AAV-Vektoren überwindet Die Einschränkungen der AONs, was zu einer fortgesetzten Expression der AONs und einer besseren Transduktion von Geweben von Interesseführt 12. Wir verwenden Zellen, die von DMD-Patienten für dieses Protokoll abgeleitet wurden, um die Exon-Skipping-Strategie zu veranschaulichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um FM-Zelllinien mit guter Qualität zu erhalten, sind einige Schritte entscheidend. Je früher die Hautbiopsie verarbeitet wird, desto größer sind die Chancen, gesunde Fibroblasten zu erhalten. Wichtig ist auch die Durchgangszahl der Fibroblastenkulturen. Primärzellen haben eine begrenzte proliferative Kapazität und treten nach vielen Passagen in reproduktiver Seneszenz ein. Daher ist es besser, einen Vorrat an Fibroblasten bei einer niedrigen Durchgangszahl zu haben und Zellen so schnell wie möglich zu transformie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Vincent Mouly für den Austausch seines Wissens in der Vergangenheit in Bezug auf das Modell. Diese Arbeit wurde vom US National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., und R.B.W.)), das US National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., und N.W.). N.W. wurde von der Ohio State University/Nationwide Children es Hospital Muscle Group und der Philippe Foundation unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch interne Diskretionsfonds unterstützt und ein Teil der exon 2-Überspringarbeit wurde auch von CureDuchenne (K.M.F.) und Association Francaise Contre Les Myopathies unterstützt. IRB-Nummer: IRB10-00358/ CR00005138 und IBCSC-Nr.: IBS00000123.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
References
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