सैकरोमाइसेस सेर्विसियाई स्पलिसिओसोम सबकॉम्प्लेक्स के क्षणिक इंटरप् इंटरेक्टर्स का पता लगाने के लिए ग्रेफिक्स का उपयोग
Summary
यहां, हम एक क्रॉसलिंकर की उपस्थिति में ग्लाइस्रोल ग्रेडिएंट अपकेंद्रित्र, ग्रेफिक्स (ग्रेडिएंट फिक्सेशन) के उपयोग का वर्णन करते हैं, जो स्प्लिकोसोम कॉम्प्लेक्स में क्षणिक रूप से बांधने वाले स्प्लिसिंग कारकों के बीच बातचीत की पहचान करता है।
Abstract
प्री-एमआरएनए स्प्लिसिंग एक बहुत ही गतिशील प्रक्रिया है जिसमें असेंबली, आरएनए प्रसंस्करण और जटिल घटकों की रिहाई के दौरान स्प्लिकोसोम सबकॉम्टेक्स के कई आणविक पुनर्व्यवस्था शामिल हैं। कार्यात्मक और संरचनात्मक अध्ययनों के लिए प्रोटीन या आरएनपी (रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन) परिसरों को अलग करने के लिए ग्लाइस्रोल ग्रेडिएंट अपकेंद्रित्र का उपयोग किया गया है। यहां, हम ग्रेफिक्स (ग्रेडिएंट फिक्सेशन) के उपयोग का वर्णन करते हैं, जिसे पहले एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए मैक्रोमॉलिकुलर परिसरों को शुद्ध और स्थिर करने के लिए विकसित किया गया था, जो स्प्लिसिंग कारकों के बीच बातचीत की पहचान करने के लिए है जो स्प्लिकोसोम कॉम्प्लेक्स में क्षणिक रूप से बांधते हैं। यह विधि परिसरों को स्थिर करने के लिए एक निर्धारण अभिवाचित की बढ़ती एकाग्रता में नमूनों के अपकेंद्रण पर आधारित है। ग्लाइसरोल ग्रेडिएंट्स पर लोड किए गए खमीर कुल अर्क के अपकेंद्रित्र होने के बाद, बरामद अंशों का विश्लेषण स्लिसियोसोम उप-परिसरों की पहचान और व्यक्तिगत स्प्लिसिंग कारकों की उपस्थिति के निर्धारण के लिए डॉट दाग द्वारा किया जाता है।
Introduction
स्प्लिसिंग एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है जिसके लिए समन्वित तरीके से कई कारकों को बाध्यकारी और जारी करने की आवश्यकता होती है। इन स्प्लिसिंग कारकों में आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन, एटीपीस, हेलीकेस, प्रोटीन किनासेस और फॉस्फेट, सर्वव्यापी लिगास शामिल हैं, अन्य1,2,3; और आणविक पुनर्व्यवस्थाओं को लेने की अनुमति देने के लिए, इनमें से कुछ कारक स्प्लिकोसोम सबकॉम्टेक्स के लिए बहुत क्षणिक रूप से बांधते हैं, जिससे इन आरएनपी मध्यवर्ती परिसरों का अलगाव और पहचान बहुत चुनौतीपूर्ण हो जाती है।
यहाँ, हमने बीएक्ट कॉम्प्लेक्स6के साथ खमीर स्प्लिसिंग फैक्टर Cwc24 की बातचीत को स्थिर करने के लिए ग्रेफिक्स विधि 4,5 का उपयोग किया ताकि उस सबकॉम्प्लेक्स के साथ-साथ अन्य कारकों की पहचान की अनुमति दी जा सके और यह निर्धारित किया जा सके कि क्या यह निर्धारित किया गया है कि क्या सर्वव्यापी ligase Prp19 उन्नीस (एनटीसी) परिसर के लिए Cwc24 के बाध्यकारी या रिहाई में किसी भी भूमिका निभाता है और सक्रियण से पहले intron के 5 ‘ अंत करने के लिए और पहली ट्रांसेस्टरिफिकेशन प्रतिक्रिया लेता है स्थान। ग्लिसरॉल ढाल के साथ क्रॉसलिंकर की बढ़ती एकाग्रता के लिए मैक्रोमॉलिक्यूल्स को उजागर करने का लाभ यह है कि यह इंटर-कॉम्प्लेक्स क्रॉसलिंक4, 5से बचाता है, और इसलिए, समुच्चय कागठन।
इस विधि का उपयोग प्रोटीन कोइमानोप्रिपिcipitेशन और पुल-डाउन परख के पूरक के रूप में किया जाता था, जो बड़े परिसरों के अलगाव की अनुमति देने के बावजूद, बड़े गतिशील परिसरों7,8के भीतर क्षणिक बातचीत को बनाए रखने के लिए विश्वसनीय नहीं हो सकता है। ग्लिसरोल ढाल में फिक्सेशन रिएजेंट्स का उपयोग ऐसे कारकों के बाध्यकारी को स्थिर करता है, जिससे सबकॉम्टेक्स के साथ विशिष्ट प्रोटीन की बातचीत की पुष्टि होती है। क्योंकि चुना क्रॉसलिंकर रासायनिक रूप से अपरिवर्तनीय था, बरामद अंशों में मौजूद प्रोटीन ढाल अपकेंद्रित्र के बाद डॉट दाग द्वारा विश्लेषण किया गया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटीन-प्रोटीन और राइबोन्यूक्लिक एसिड-प्रोटीन इंटरैक्शन को क्रॉसलिंकिंग एजेंटों का उपयोग करके स्थिर किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है कि परिणामी परिसर ग्लिसरोल ढाल पर अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन का स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एफएपीईपी ग्रांट (15/06477-9) ने सपोर्ट किया ।
Materials
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
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