Användning av Grafix för påvisande av transienta interactorer av Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes
Summary
Här beskriver vi användningen av Grafix (Gradient Fixation), en glycerolgradient centrifugation i närvaro av en korslänkare, för att identifiera interaktioner mellan splitsfaktorer som binder tillfälligt till skarveosome komplexet.
Abstract
Pre-mRNA-splitsning är en mycket dynamisk process som involverar många molekylära omorganiseringar av de skarveosome subkomplexerna under montering, RNA-bearbetning och frisättning av de komplexa komponenterna. Glycerolgradientcentrifugation har använts för separation av protein- eller RiboNucleoProtein-komplex (RiboNucleoProtein) för funktionella och strukturella studier. Här beskriver vi användningen av Grafix (Gradient Fixation), som först utvecklades för att rena och stabilisera makromolekylära komplex för enstaka partikel cryo-elektronmikroskopi, för att identifiera interaktioner mellan splitsfaktorer som binder tillfälligt till skapliceosome komplexet. Denna metod är baserad på centrifugation av prover till en ökande koncentration av ett fixeringsreagens för att stabilisera komplexen. Efter centrifugation av jäst totala extrakt laddade på glycerol gradienter, återhämtade fraktioner analyseras av dot blot för identifiering av skarveosome subkomplex och bestämning av förekomsten av enskilda splitsfaktorer.
Introduction
Splitsning är en mycket dynamisk process som kräver bindning och frigörelse av en mängd faktorer på ett samordnat sätt. Dessa splitsfaktorer inkluderar RNA-bindande proteiner, ATPases, helicases, proteinkinaser och fosfataser, ubiquitin ligaser,bland andra 1,2,3; och för att möjliggöra molekylära omorganiseringar, binder några av dessa faktorer mycket tillfälligt till de skarveosome subcomplexesna, vilket gör isoleringen och identifieringen av dessa RNP mellanliggande komplex mycket utmanande.
Här, Vi använde Grafix-metoden4,5 för att stabilisera interaktionen mellan jästsplikationsfaktorn Cwc24 ochB-aktkomplexet 6 för att möjliggöra identifiering av andra faktorer som samtidigt är bundna till denna subkomplex och avgöra om ubiquitin ligase Prp19 spelar någon roll i bindningen eller frisättningen av Cwc24 till nittonde (NTC) komplexet och till 5′ änden av intronen före aktivering och den första transesterifieringsreaktionen tar plats. Fördelen med att utsätta makromolekylerna för en ökande koncentration av tvärlänken längs glycerolgradienten är att den undviker interkomplexkorslänkar 4,5, och därför bildandet av aggregat.
Denna metod användes som komplement till proteinkoimmunoprecipitation och pull-down-analyser, som trots att de tillåter isolering av stora komplex kanske inte är tillförlitliga för att upprätthålla tillfälliga interaktioner inom stora dynamiska komplex7,8. Användningen av fixeringsreagenser i glycerolgradienten stabiliserar bindningen av sådana faktorer, vilket gör det möjligt att bekräfta interaktioner mellan specifika proteiner och splitsande subkomplexer. Eftersom den valda tvärlänken var kemiskt irreversibel analyserades proteiner som finns i de återvunna fraktionerna av dot blot efter gradientcentrifugationen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein-protein och ribonukleinsyror-protein interaktioner kan stabiliseras med hjälp av korslänkningsmedel. Det är viktigt att det resulterande komplexet är stabilt för att motstå ultracentrifugation på glycerolgradient. Dessutom bör buffertvillkoren tillåta interaktionen, men vara tillräckligt stränga för att undvika icke-specifik bindning. I experimenten som visas här använde vi en buffertlösning som redan fastställts för in vitro-splitsreaktioner15.
<p class="jove_content"…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett FAPESP-bidrag (15/06477-9).
Materials
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).
- Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
- Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
- Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
- Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
- Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
- Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3′ splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
- Dunn, E. A., Rader, S. D., Hertel, K. J. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1126, 123-135 (2014).
- Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
- Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
- Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. Yeast mRNA splicing in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).
