L’objectif de ce protocole est de permettre l’édition CRISPR/Cas9 transparente du génome de C. elegans en utilisant des complexes de ribonucléoprotéines assemblés et le marqueur co-CRISPR dpy-10 pour le dépistage. Ce protocole peut être utilisé pour effectuer une variété de modifications génétiques chez C. elegans, y compris des insertions, des délétions, des remplacements de gènes et des substitutions de codon.
Le système bactérien CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) /Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) a été exploité par les chercheurs pour étudier d’importants problèmes biologiquement pertinents. La puissance inégalée de la méthode d’édition du génome CRISPR/Cas permet aux chercheurs d’éditer avec précision n’importe quel locus de leur choix, facilitant ainsi une meilleure compréhension de la fonction des gènes. Plusieurs méthodes d’édition du génome de C. elegans par CRISPR/Cas9 ont été décrites précédemment. Ici, nous discutons et démontrons une méthode qui utilise des complexes de ribonucléoprotéines assemblés in vitro et le marqueur co-CRISPR dpy-10 pour le dépistage. Plus précisément, dans cet article, nous passons par le processus étape par étape d’introduction de codons d’arrêt prématuré dans le gène C. elegans rbm-3.2 par réparation dirigée par homologie en utilisant cette méthode d’édition CRISPR / Cas9. Cette méthode d’édition relativement simple peut être utilisée pour étudier la fonction de n’importe quel gène d’intérêt et permet la génération de C. elegans édités homozygotes par édition CRISPR / Cas9 en moins de deux semaines.
La technologie CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) / Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) permet une édition ciblée efficace du génome dans un large éventail d’organismes1,2,3,4. Le système CRISPR a d’abord été découvert dans le cadre d’une réponse immunitaire antivirale procaryote5,6,7. Le système CRISPR de type II utilise une endonucléase telle que Cas9, un ARN transactivant (tracrRNA) et un court guide cible à 20 nucléotides spécifiques à l’ADN CRISPR (ARNc) pour reconnaître un protospacer adjacent (PAM) « NGG » et faire une rupture double brin dans l’ADN cible5,6,7,8,9,10,11,12. Cette cassion double brin est reconnue comme une lésion par la machinerie de réparation de l’ADN cellulaire. Par conséquent, la rupture double brin générée peut être réparée par l’une des deux voies : i) Jointure d’extrémité non homologue (NHEJ) ou ii) Réparation dirigée par homologie (HDR)13. Le NHEJ est souvent sujet aux erreurs et, par conséquent, lorsque cette voie est utilisée pour réparer la rupture double brin dans l’ADN cible, elle provoque souvent des mutations inactivantes (insertions, délétions) dans le gène d’intérêt. D’autre part, en fournissant un gabarit de réparation exogène avec homologie de part et d’autre de la rupture double brin, la machinerie de réparation de l’ADN cellulaire peut être dirigée vers l’utilisation de HDR pour réparer la casse13. La méthode HDR permet ainsi un montage précis de tout lieu d’intérêt.
Divers protocoles d’édition de gènes CRISPR/Cas9 ont été décrits pour C. elegans14,15,16,17,18,19,20. Les méthodes d’édition CRISPR/Cas9 les plus couramment utilisées dans C. elegans incluent à la fois des protocoles basés sur le clonage et sans clonage pour générer des modèles de réparation pour l’édition CRISPR/Cas914,15,16,17,18,19,20. Ce protocole traite en détail d’un protocole d’édition CRISPR/Cas9 sans clonage basé sur l’utilisation de dpy-10 comme marqueur co-CRISPR pour le dépistage. Jusqu’à présent, le seul protocole vidéo de montage CRISPR/Cas9 détaillé axé sur C. elegansqui existe utilise un marqueur fluorescent pour ledépistage 21. Cependant, l’utilisation d’un marqueur fluorescent pour le dépistage nécessite l’accès à un microscope à fluorescence, auquel de nombreux laboratoires de petits établissements principalement de premier cycle (PUI) peuvent trouver difficile d’accès. Il est encourageant de noter que des résultats corrélatifs positifs ont été obtenus dans des études antérieures entre des vers porteurs de marqueurs fluorescents et la présence de l’edit21,22. Cependant, des études supplémentaires sont nécessaires pour déterminer l’efficacité globale de la méthode de criblage basée sur la fluorescence pour l’édition d’une grande variété de loci avec différents ARN guides et modèles de réparation. Enfin, puisque les plasmides codés pour ces marqueurs fluorescents forment des réseaux extrachromosomiques, une fluorescence variable est souvent produite à partir de ces réseaux qui peuvent rendre les positifs difficiles à identifier23. Par conséquent, bien que la méthode de criblage basée sur la fluorescence puisse être utile à adopter, les questions susmentionnées peuvent limiter son applicabilité.
L’utilisation d’un marqueur co-CRISPR qui produit un phénotype visible réduit considérablement le nombre de descendance qui doivent être filtrées pour trouver un ver édité positivement23,24,25,26,27,28. Il est important de savoir que les phénotypes produits par ces marqueurs peuvent être facilement détectés sous un simple microscope à dissection23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Le marqueur co-CRISPR dpy-10 est l’un des marqueurs co-CRISPR les mieux caractérisés et largement utilisés pour effectuer l’édition du génome C. elegans CRISPR / Cas924,27. Par conséquent, cet article discutera de la méthode d’exécution de l’édition CRISPR / Cas9 chez C. elegans en utilisant l’administration directe de complexes ribonucléoprotéiques avec dpy-10 comme marqueur co-CRISPR27,35. Dans cette méthode, le mélange d’injection d’édition préparé consiste en un ARNc dpy-10 bien caractérisé et un modèle de réparation dpy-10 pour médier la génération d’un phénotype dominant observable « rouleau » (Rol) qui est conféré par une mutation hétérozygote connue dpy-10 (cn64) dans le gène dpy-10 24,27,29. Lorsqu’elle est présente dans son état homozygote, la mutation dpy-10(cn64) provoque un phénotype dumpy (Dpy) qui produit des vers plus courts et plus robustes24,29. Le phénotype Rol est médié par l’insertion précise du modèle de réparation dpy-10 co-fourni dans une seule copie du gène dpy-10 par édition CRISPR / Cas9 médiée par HDR. Par conséquent, l’apparition de Rol C. elegans indique une injection réussie ainsi qu’un événement d’édition réussi médié par HDR dans les cellules du ver injecté. Étant donné que l’ARNcr et le gabarit de réparation du gène cible d’intérêt sont dans le même mélange d’injection que l’ARNc dpy-10 et le gabarit de réparation dpy-10, il y a de fortes chances que les vers Rol identifiés aient également été modifiés simultanément au niveau du gène cible d’intérêt. Par conséquent, ces vers Rol sont ensuite examinés pour l’édition d’intérêt par des techniques telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) (pour les modifications supérieures à 50 pb) ou par PCR suivie d’une digestion de restriction (pour les modifications inférieures à 50 pb).
Les avantages de l’utilisation de cette méthode pour l’édition du génome sont les suivants: i) les modifications CRISPR peuvent être générées à une efficacité relativement élevée (2% à 70%) en utilisant cette méthode27; ii) les modèles de réparation et les ARN guides utilisés dans cette méthode n’impliquent pas de clonage, ce qui réduit le temps nécessaire à leur génération; iii) en assemblant des complexes ribonucléoprotéiques in vitro,les concentrations des complexes d’édition assemblés peuvent être maintenues relativement constantes, améliorant ainsi la reproductibilité; iv) il a été démontré que certains ARN guides qui ne génèrent pas de modifications lorsqu’ils sont exprimés à partir de plasmides fonctionnent pour l’édition du génome CRISPR/Cas9 lorsqu’ils sont fournis sous forme d’ARN crrnaques transcrits in vitro 27; v) l’inclusion du marqueur co-CRISPR dpy-10 permet un dépistage facile à l’aide d’un microscope à dissection et diminue le nombre de descendance qui doivent être dépistées pour trouver des positifs24,27; et vi) les lignées de vers homozygotes vérifiées par séquençage de l’ADN peuvent être obtenues par cette méthode en quelques semaines19,27.
D’excellents chapitres de livres relatifs à de nombreuses méthodes CRISPR de C. elegans ont été publiés14,15,16,17,18,19,20,43. Cependant, la démonstration de la méthode dpy-10 co-CRISPR dans un format vidéo en laboratoire fait actuellement défaut. Dans cet article, nous décrivons et démontrons le processus d’utilisation de la méthode dpy-10 co-CRISPR pour éditer un gène cible représentatif nommé rbm-3.2, une protéine putative de liaison à l’ARN (WormBase:https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). Plus précisément, nous décrivons ici en détail la méthode d’introduction de trois codons d’arrêt prématuré dans le gène C. elegans rbm-3.2 en utilisant des complexes ribonucléoprotéiques assemblés in vitro et un modèle de réparation monocatélique linéaire fourni de manière exogène. Ces études ont réussi à générer la première souche CRISPR de C. elegans avec des codons d’arrêt prématuré dans le gène rbm-3.2. Étant donné que l’on ne sait pas grand-chose actuellement sur la fonction de ce gène chez C. elegans, cette souche servira d’outil utile pour disséquer la fonction du RMB-3.2. Cette méthode peut également être adoptée pour effectuer des insertions, des substitutions et des délétions à n’importe quel locus du génome de C. elegans.
Nous avons utilisé le protocole ci-dessus pour modifier plusieurs gènes en plus de rbm-3.2. Nos efficacités d’édition pour différents loci, ARN guides et modèles de réparation (simple brin et double brin) ont varié entre 2% et 58% (données non présentées). Les gains d’efficacité d’édition observés sont comparables aux gains d’efficacité d’édition précédemment signalés de 2 % à 70 % pour ce protocole27. Nous avons également réussi à utiliser cette technique pour effectuer des délétions de gènes. À l’aide de deux ARNrc, nous avons remplacé un gène d’une longueur proche de 6 kb par la séquence codante de la protéine fluorescente verte (GFP) (données non présentées). Pour cette expérience, environ 14% des vers Rol F1 analysés se sont révélés positifs pour la délétion du gène et le remplacement par GFP (données non montrées). Cependant, des expériences supplémentaires sont nécessaires pour déterminer la durée maximale des délétions et des remplacements de gènes qui peuvent être effectués à l’aide de cette technique.
Cette technique peut être utilisée pour faire des insertions d’environ 1,6 kb de longueur19. Une étude récente a montré que pour faire des insertions de plus de 1,6 kb de longueur en utilisant ce protocole, générer deux cassures double brin et utiliser des modèles de réparation avec des bras d’homologie plus longs peut permettre l’insertion de fragments d’ADN beaucoup plus grands (~10 Kb)28. Alternativement, plusieurs cycles d’édition de gènes avec ce protocole peuvent être effectués pour générer des modifications plus importantes. D’autres protocoles d’édition de gènes CRISPR/Cas9 à base de plasmides peuvent également être adoptés pour les expériences CRISPR impliquant l’insertion de fragments d’ADN supérieurs à 1,6 kb46,47,48.
Avant d’utiliser ce protocole pour l’édition de gènes, il est nécessaire de s’assurer que le gène d’intérêt n’est pas lié au locus dpy-10 sur le chromosome II. Dans le cas où un gène cible est lié à dpy-10, il peut être problématique de séparer la mutation dpy-10 de votre édition d’intérêt. Par conséquent, dans le cas où le gène d’intérêt est lié au locus dpy-10, d’autres marqueurs co-CRISPR tels que unc-58 (chromosome X),unc-22 ou zen-4 (chromosomeIV), et ben-1 ou pha-1 (chromosome III) qui sont situés sur différents chromosomes peuvent être utilisés24,25,26,28. Les données du laboratoire Meyer démontrent que les mutations ben-1 et zen-4 peuvent être utilisées comme marqueurs co-CRISPR réussis pour le dépistage avec cette méthode28. Cependant, il est important de noter que l’utilisation de zen-4 et pha-1 comme marqueurs co-CRISPR nécessite la réalisation de l’expérience CRISPR dans des arrière-plans zen-4 (cle10ts) ou pha-1 (e2123ts) de type non sauvage respectivement26,28. En outre, les expériences CRISPR impliquant certains marqueurs co-CRISPR tels que ben-1 peuvent nécessiter la préparation de plaques spéciales (par exemple des plaques contenant du benzimidazole)28. Nous avons utilisé avec succès le marqueur co-CRISPR unc-58 pour dépister les modifications positives d’un gène lié au dpy-10 en utilisant cette méthode (données non présentées). La mutation unc-58(e665) confère un phénotype visible (paralysie) qui peut être utilisé efficacement pour dépister les vers modifiés positivement24. Alternativement, si l’accès à un microscope fluorescent est disponible, un gène gtbp-1 marqué par fluorescence peut également être utilisé comme marqueur co-CRISPR pour ce protocole19.
Pour une efficacité d’édition élevée lors de l’utilisation de cette méthode d’édition du génome, le site d’édition doit se situer entre 10 et 30 bases à partir du site de découpe Cas9. Si le site d’édition est à plus de 30 bases du site de découpe Cas9, l’efficacité d’édition diminue drastiquementde 19,35,37. Cependant, une étude récente du laboratoire Meyer a démontré que la création de deux cassures double brin à distance l’une de l’autre peut permettre l’insertion d’éditions loin du site de coupe Cas9 en utilisant ce protocole28.
Dans le protocole actuel, le modèle de réparation a été conçu de manière à ce que les trois codons d’arrêt insérés apparaissent dans le même cadre de lecture. Cependant, une stratégie alternative pour créer des mutants nuls serait d’utiliser une cassette STOP-IN universelle de 43 bases qui a été décrite précédemment50. Il est important de se faire une évidence que cette cassette a des codons d’arrêt dans les trois cadres de lecture possibles et provoque des mutations de décalage de cadre. Il s’agit d’une stratégie particulièrement utile pour générer des mutants nuls lorsque des réparations incorrectes ou incomplètes se produisent sur le site d’édition.
En conclusion, en raison de sa courte durée et des progrès récents de cette méthode, il s’agit d’une excellente méthode pour les expériences de laboratoire de routine impliquant l’ajout de courtes étiquettes d’épitope immunogènes, de balises fluorescentes, de délétions de gènes, de remplacements de gènes et de substitutions de codon.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de l’Université de Tulsa (TU) et la bourse d’été de développement du corps professoral de l’Université de Tulsa décernée à Jyoti Iyer. Nous tenons à remercier le Programme de recherche d’été en chimie de premier cycle (CSURP) et le Tulsa Undergraduate Research Challenge (TURC) d’avoir décerné des allocations aux étudiants participant à cette étude. Nous tenons à remercier Mme Caroline Dunn pour son aide technique. Enfin, nous tenons à remercier les Drs Jordan Ward, Aimee Jaramillo-Lambert, Anna Allen, Robert Sheaff, William Potter et Saili Moghe pour leurs commentaires critiques sur ce manuscrit.
Barcoded DNA sequencing tubes | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Premixed | N/A |
Cas9 protein | PNA Bio | CP01 | Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C |
crRNAs | Horizon Discovery/ GE Dharmacon | N/A | Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C |
ECoRI | New England Biolabs | R3101S | Stored at -30 °C |
Minelute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | Spin columns stored at 4 °C |
MyTaq Redmix | Meridian Bioscience | BIO-25043 | Stored at -30 °C |
Primers | IDT | N/A | Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C |
Proteinase K | Gold Bio | P-480-SL4 | Stored at -30 °C |
Repair template oligos | IDT | N/A | 4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C |
tracrRNA | Horizon Discovery/ GE Dharmacon | U-002005-50 | Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C |