Summary
このプロトコルの目的は、組み立てられたリボヌクレオタンパク質複合体とスクリーニングのためのdpy-10コクリスピーマーカーを使用して、C.エレガンスゲノムのシームレスなCRISPR / Cas9編集を可能にすることです。このプロトコルは、挿入、欠失、遺伝子置換およびコドン置換を含むC.エレガンスにおける様々な遺伝子改変を行うために使用することができる。
Abstract
細菌クラスター化された定期的に間隔を合わせた短いパリンドロミックリピート(CRISPR)/ストレプトコッカスピオゲネス CRISPR関連タンパク質(Cas)システムは、研究者によって利用され、重要な生物学的関連の問題を研究しています。CRISPR/Casゲノム編集法の比類のないパワーにより、研究者は選択した軌跡を正確に編集することができ、遺伝子機能の理解を深めます。CRISPR/Cas9による C.エレガンス ゲノムを編集するためのいくつかの方法が先に説明されている。ここでは、 インビトロ 組み立てリボヌクレオプロテイン複合体と dpy-10 コCRISPRマーカーをスクリーニングに利用する方法について議論し、実証する。具体的には、この記事では、CRISPR/Cas9編集のこの方法を使用して相同性指向の修復によって C.エレガンスrbm-3.2 遺伝子に早期停止コドンを導入するステップバイステップのプロセスを経ます。この比較的単純な編集方法は、関心のある任意の遺伝子の機能を研究するために使用することができ、2週間以内にCRISPR / Cas9編集によるホモ接合編集 C.エレガンス の生成を可能にする。
Introduction
クラスター化された間隔間短パリンドロミック反復(CRISPR)/ストレプトコッカスpyogenes CRISPR関連タンパク質(Cas)技術により、広範囲の生物1、2、3、4における効率的な標的ゲノム編集が可能になる。CRISPRシステムは、原核生物抗ウイルス免疫応答5、6、7の一部として最初に発見された。タイプII CRISPRシステムは、Cas9、トランスアクティベートRNA(tracrRNA)および短い標的DNA特異的20ヌクレオチドロングガイドCRISPR RNA(crRNA)などのエンドヌクレアーゼを使用して、「NGG」プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識し、標的DNA5、6、7、8、9、10、11、12に二本鎖の破断を行う。この二本鎖破断は、細胞DNA修復機械によって病変として認識される。その結果、生成された二本鎖破断は、2つの経路(i)非相同端結合(NHEJ)またはii)相同性指向修復(HDR)13のいずれかによって修復することができる。NHEJは誤りが多く、したがって、この経路が標的DNAの二本鎖破断を修復するために使用されると、しばしば目的の遺伝子に不活性化突然変異(挿入、欠失)を引き起こす。一方、二本鎖破断の両側に相同性を有する外因性修復テンプレートを供給することにより、細胞DNA修復機械は、破断13を修復するためにHDRを使用するように指示することができる。HDR法は、したがって、関心のある任意の遺伝子座の正確な編集を可能にします。
C. elegans14、 15、16、17、 18 、19、20に関して、さまざまな CRISPR/Cas9 遺伝子編集プロトコルが記載されています。 C. elegansで最も一般的に採用されている CRISPR/Cas9 編集方法には、CRISPR/Cas9 編集14、15、16、17、18、19、20の修復テンプレートを生成するためのクローニングベースとクローニングフリーの両方のプロトコルが含まれます。このプロトコルは、スクリーニングのためのコCRISPRマーカーとしてdpy-10を使用することに基づくクローニングフリーCRISPR/Cas9編集プロトコルについて詳細に議論します。これまで、存在する唯一の詳細なC.エレガンス焦点CRISPR/Cas9編集ビデオプロトコルは、スクリーニング21に蛍光マーカーを利用している。しかし、蛍光マーカーをスクリーニングに使用するには蛍光顕微鏡へのアクセスが必要であり、主に学部の小さな機関(PUI)の多くの研究室ではアクセスが困難になる可能性があります。蛍光マーカーを持つワームと編集21,22の存在との間の以前の研究では肯定的な相関結果が得られていることに注意することが奨励される。しかし、異なるガイドRNAと修復テンプレートを用いて多種多様な遺伝子座を編集するための蛍光ベースのスクリーニング方法の全体的な効率を決定するために、追加の研究が必要です。最後に、これらの蛍光マーカーをコードするプラスミドは染色体外配列を形成するので、これらのアレイから可変蛍光が生成されることが多く、23の検出が困難な陽性を作り出すことができる。したがって、蛍光ベースのスクリーニング方法は採用に有用であるかもしれないが、上記の問題はその適用性を制限する可能性がある。
可視表現型を生成する共CRISPRマーカーを使用すると、肯定的に編集されたワーム23、24、25、26、27、28を見つけるためにスクリーニングする必要がある子孫の数を大幅に減らすことができます。重要なことに、これらのマーカーによって生成される型は、簡単な解剖顕微鏡23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34の下で容易に検出することができる。dpy-10コクリスプマーカーは、C.エレガンスCRISPR/Cas9ゲノム編集24、27を行うための最も特徴があり、広く使用されている共CRISPRマーカーの1つである。そこで、この記事では、c.エレガンスにおけるCRISPR/Cas9編集を、コCRISPRマーカー27,35としてdpy-10を用いたリボヌクレオプロテイン複合体の直送を用いて行う方法について説明する。この方法では、準備された編集注入ミックスは、dpy-10遺伝子24、27、29の中で既知のヘテロ接合性dpy-10(cn64)突然変異によって与えられる観察可能な支配的な「ローラー」(Rol)表現型の生成を仲介するために、よく特徴付けられるdpy-10 crRNAとdpy-10修復テンプレートからなる。 そのホモ接合状態で存在すると、dpy-10(cn64)突然変異は、短く、より短く、スタボワーム24、29を生成するダンプリー(Dpy)表現型を引き起こす。Rol表現型は、HDR媒介型CRISPR/Cas9編集によってdpy-10遺伝子の単一コピーに共同提供のdpy-10修復テンプレートを正確に挿入することによって仲介される。したがって、Rol C. elegansの出現は、注射に成功した注射と、注入されたワームの細胞内で成功したHDR媒介編集イベントを示しています。対象となる標的遺伝子のcrRNAおよび修復テンプレートは、dpy-10 crRNAおよびdpy-10修復テンプレートと同じ注入ミックスにあるため、同定されたRolワームも対象の標的遺伝子でも同時に編集された可能性が高い。したがって、これらのロルワームは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(50 bpを超える編集)やPCR、制限消化(50bp未満の編集)などの技術によって、関心のある編集のためにスクリーニングされます。
この方法をゲノム編集に使用する利点は、i) CRISPR 編集は、この方法27を使用して比較的高い効率 (2% ~ 70%) で生成できます。ii) この方法で使用されている修復テンプレートとガイド RNA は、クローン作成を伴わないため、その生成に必要な時間を短縮します。iii) リボヌクレオプロテイン複合体をインビトロで組み立てることで、組み立てられた編集複合体の濃度は比較的一定に維持することができ、再現性を向上させる。iv) プラスミドから発現したときに編集を生成できないいくつかのガイドRNAは、インビトロ転写crRNA27として供給されたCRISPR/Cas9ゲノム編集のために働くことを示されている。v)dpy-10コクリスプRマーカーを含む解剖顕微鏡を使用して容易にスクリーニングを可能にし、陽性24、27を見つけるためにスクリーニングしなければならない子孫の数を減少させる。vi) DNAシーケンシング検証済みのホモ接合性のワームラインは、数週間19、27週間以内にこの方法によって得ることができる。
多くの異なるC.エレガンスCRISPRメソッドに関する優れた本の章は、14、15、16、17、18、19、20、43で出版されています。しかし、実験室での設定でビデオ形式でのdpy-10コCRISPR法のデモンストレーションは現在欠けています。この記事では、dpy-10コCRISPR法を使用して、RNA結合タンパク質であるRBm-3.2という代表的な標的遺伝子(WormBase:https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10)を編集するプロセスについて説明し、デモンストレーションを行います。 具体的には、ここでは、in vitro組み立てリボヌクレオタンパク質複合体および外因的に供給された線形一本鎖修復テンプレートを使用してC.elegans rbm-3.2遺伝子内に3つの早期停止コドンを導入する方法を詳細に説明する。これらの研究は、rbm-3.2遺伝子における早期停止コドンを有する最初のC.エレガンスCRISPR株の生成に成功している。C.エレガンスにおけるこの遺伝子の機能に関しては現在あまり知られていないので、この株はRMB-3.2の機能を解剖するのに有用なツールとして役立つであろう。この方法は、C.エレガンスゲノム内の任意の遺伝子座で挿入、置換、および欠失を行うためにも採用することができます。
Protocol
CRISPR/Cas9ゲノム編集のためのこのプロトコルは、NIHガイドラインに従ってタルサ大学機関バイオセーフティ委員会によって承認されました。このプロトコルを通して、無菌技術が実践された。このプロトコルのすべてのステップは、ヌクレアーゼを含まない試薬を用いて行った。洗浄手袋、作業スペース、機器(ピペット、ガラス製品の外装など)などのRNase汚染を防止するために、RNase除染液を使用して特別な注意を払いました。
1. crRNA設計
- 編集サイトに最も近い Cas9 を切り取る PAM を見つけます。
- PAMサイトは5'-NGG-3'です。
- PAMはDNAのどちらの鎖にも含まれる可能性があることを覚えておいてください。
- CRRNA配列としてPAMの5'末端に20 bpを選択します。
注: 商業企業によって合成される実際の crRNA 配列は、合成会社によって標的特異的な 20 bp crRNA 配列に自動的に付加される追加の一般配列を有するので 20 bp より長い。オフターゲット効果に関しては、最近の研究では、C.エレガンス36、37、38、39、40のCas9のオフターゲット効果は見つかっていません。さらに、結果として生じるCRISPR編集株は交差している。したがって、設計されたcrRNAのオフターゲット効果についてはあまり心配していません。しかし、http://genome.sfu.ca/crispr/ や http://crispor.tefor.net/ を含むオンラインウェブサイトを使用して、ターゲットの効果が最も少ないcrRNAを38、41で検索して選択することができます。GまたはGGで終わり、GC含有量が50%を超えるcrRNAは、より効率的な19、23、42であると予測されています。 - crRNAの少なくとも10 nmolを会社から注文する(例えばIDT、ホライズン・ディスカバリー、等)。
- 凍結乾燥したcrRNAが到着したら、マイクロインジェクションの日まで-30°Cで保管してください。
- マイクロインジェクションを行った日に、凍結乾燥したcrRNAを最高速度(17,000 x g)で1分間回転させ、5 mM Tris-Cl(pH 7.4)で再懸濁してcrRNAの8 μG/μLストックを作ります。
- 未使用のcrRNAストックを-80°Cで冷凍保存してください。
2. 修復テンプレートの設計
- シーケンス操作ソフトウェア(例えば、CLCシーケンスビューア、APE、スナップ遺伝子、ベクトルNTIなど)をダウンロードします。CLCシーケンスビューアバージョン8.0(Qiagen)はユーザーフレンドリーで無料でダウンロードできます。
- 目的のターゲットDNAの配列を配列ビューアに貼り付けます。
- 修復テンプレートの向きは、編集効率28に影響を与えます。PAMの5'末端に修復配列を挿入するために、PAM配列が配置されているのと同じDNA鎖(プロトスペンサー鎖)28からのDNA配列を持つ一本鎖修復テンプレートを設計する。PAMの3'末端に修復配列を挿入する間、PAM配列(スペーサー鎖)28を運ばないDNA鎖からのDNA配列を持つ一本鎖修復テンプレートを設計する。
- 編集の両側(5'と3'の終わり)に中断されていない相同性を持つシーケンスの35塩基対を選択します。
- 修復テンプレートまたは編集されたゲノム DNA を Cas9 で切断しないように PAM を変更または削除します。
- PAMの突然変異が不可能な場合は、PAMの5'末端に近いいくつかの無静な突然変異を導入して、修復テンプレートまたは編集されたゲノムDNAの切断を防ぎます。
- パムの静かな変異がエキコニック領域に存在する場合にのみ、この PAM の変異を導入するようにしてください。
- コドンの使用頻度をチェックして、突然変異したコドンが元の非突然変異コドンに匹敵する頻度で導入されていることを確認してください(例 https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table)。場合によっては、変異したコドンを変異させたコドンと同様の頻度で導入することができない場合がある。しかし、いくつかのアミノ酸の変異を作るためには、変異タンパク質の発現量が大きく変化するとは考えていない。
- 編集が小さい場合(例えば、数塩基の突然変異)、サイレント突然変異によって編集に近いユニークな制限部位を導入する。http://heimanlab.com/cut2.html を使用して、サイレント突然変異誘発によって導入できる制限部位を見つけます。
- コドンの使用頻度を確認して、突然変異したコドンが元の非突然変異コドンに匹敵する頻度で導入されていることを確認します。前述のように、これは常に可能であるとは限りません。しかし、数個のアミノ酸の変異を含む実験では、変異タンパク質の発現量が大きく変化するとは考えていない。
- 4 nmolウルトラマーオリゴとしてHDRのための線形一本鎖修理テンプレートを合成し、購入。
- 凍結乾燥したオリゴヌクレオチド修復テンプレートをヌクレアーゼフリー水中に再中断し、修復テンプレートの1 μg/μLストックを作り、さらに使用するまで-30°Cで保存します。
3. プライマー設計のスクリーニング
- CLC配列ビューアまたは他の類似のアプリケーションを使用して、それぞれ編集の両側に20〜23のベースペアフォワードとリバースプライマーを設計し、PCR増幅時に400〜600塩基対の間のバンドを生成するようにします。
- 数キロベースの大きな挿入の場合は、修復テンプレートの左相同性アームのすぐ外側に配置されるフォワードプライマーを設計します。修復テンプレート自体内に配置されるリバースプライマーを設計します。この場合、正に編集されたワームの場合にのみPCR産物が得られます。
- 長い挿入のためにホモ接合性の編集されたワームを識別するには、挿入接合部の外側に配置されている前方および逆プライマーを設計することによって、挿入の領域全体を増幅します。
- 遺伝子型入力用プライマーを使用する前に、プライマーをテストし、野生型ゲノム DNA で PCR 条件を最適化します。
- ゲノムDNAのPCR増幅時に、期待サイズの単一バンドが生成されることを確認します(該当する場合)。
4. 若い成人虫の注射の準備
- L2-L3ステージ C.エレガンスを MYOBプレートの新鮮な細菌の芝生に選び、一晩で20°Cでインキュベートします。
注: MYOB プレートを作るためのプロトコルは、ここで見つけることができます: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/ - マイクロインジェクションの日に、注入する子宮内の胚が10未満の若い成虫を選ぶ。
5. 注入ミックスの準備
- 滅菌ヌクレアーゼフリーチューブで 表1 に示したのと同じ順序で注入ミックスを準備します。
注:このミックスで将来の注入が予想されない場合、注入ミックスの成分をスケールダウンして5 μLインジェクションミックス(20 μLではなく)を行うことができます。 - ピペットで注入ミックスを混ぜます。
- 37°Cで15分間インキュベートし、リボヌクレオプロテイン複合体を組み立てます。
- 17,000 x g で 4 °C で 5 分間、注入ミックスを回転させます。
6. C.エレガンス 生殖腺へのマイクロインジェクション
- 2019年43日に記載されているように、C.エレガンス生殖腺へのCRISPR注入ミックスのマイクロインジェクションを行う。
- CRISPR注射ミックスで約30ワームを注入します。未使用の注入ミックスは、効率49を失うことなく、約6ヶ月の期間の4°Cで保存することによって再利用することができます。
- 可能であれば、両方の生殖腺の腕を注入します。注入されたワームはP0 世代と考えられる。
7. 注入されたワームの回復と転送
- マイクロインジェクション後、ワームピックを使用してマイクロインジェクションP0 ワームをOP50 大腸菌 で播種した60mmMYOB寒天プレートに移動させ、室温で約1時間回復させます。
- 回復温度は、注入されたワームの遺伝子型に依存するに注意してください。例えば、温度感受性株の場合、異なる温度でのワーム回復が必要な場合がある。
- 白金ワイヤーワームピックを使用して、注入された各ワームを単一の播種35mmMYOB寒天ペトリプレートに移し、翌日まで20°Cで卵を産まできるようにする。
- 一部のワームは、マイクロインジェクション手順による傷害の結果として死ぬことに注意してください。生きているワームだけを選び、動きを示してください。
- 24時間後、注射されたワームを新しい個々のプレート(プレートあたり1ワーム)に移します。
8. Cを選ぶ.スクリーニングのためのエレガンス
- 注射を行った後、20°Cで3〜4日、解剖顕微鏡を使用して注入されたワームの子孫を含むすべてのプレートを監視します。
- F1 前立腺展示ローラー(Rol)とダンプリー(Dpy)の現象を持つプレートを特定します。Dpy表現型は、同じ発達段階でワームを制御するよりも短く、頑丈に見える場所です(WormBase:https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0--10)。RolとDpyワームを持つプレートは、F1 子孫が、それぞれ異種性またはホモ接合状態で存在する dpy-10(cn64)突然変異 で正常に編集されたプレートを表します。
- スクリーニングのための最もローラーとダンプワームとプレートを選びます。
- これらのプレートから自分の個々のプレート(プレートあたり1ワーム)に50〜100 F1 Rolワームをシングルアウトし、卵を産むことを可能にします。
- L4段入りF1 ロルワームが卵を産み、1〜2日間子孫(F2)を生成することを許可します。
9. 単一ワームのリシスとPCR
- F2を1〜2日間生産した後、各シングルF1ロルマザーを2.5μLの溶解バッファー (表2)に移し、1:100希釈して20mg/mLプロテイナーゼKを行います。
- チューブを-30°Cで20分間凍らせます。ワームは、さらなる分析まで長期間この段階で保存することができます。
- 1時間、95°C、15分間、4°Cで保持する:PCRサーモサイクラー上で単一のワームのリシスを行います。
- 以下の試薬をPCRチューブを含むリセドワームの2.5 μLに直接添加します:dMP、DNAポリメラーゼ、MgCl2 およびローディング色素を含む2x PCRミックスの12.5 μL、10 μMフォワードプライマーの1 μL、1μLの10 μM逆プライマー、滅菌水を22.5μLにします。各PCR反応の総体積は25μLです。
注:複数のF1 ワームをスクリーニングする場合、複数の反応に対してPCRマスターミックスを作成し、各ライシスチューブに22.5 μLのマスターミックスを追加する方が高速で便利です。 - サーモサイクラーにPCR反応を設定し、1分間95°C、15sで95°Cの35サイクル、15sの55°C(プライマーセットごとに最適化)、72°C(各標的DNAに最適化)44。4 °Cで反応を保持します。
10. 制限消化とアガロースゲル電気泳動
注意: 制限の消化は、小さな編集(50 bp未満)のスクリーニング中にのみ必要です。
- ステップ9から新しいチューブにPCR DNAの10 μLを移します。
- 15 μL反応あたり、2~4単位の制限酵素と1x制限酵素バッファー(1.5 μLの10x反応バッファー)を加えます。
- 37°C(または他の酵素特異的温度)で2時間インキュベートする(速効性酵素でインキュベーション時間を短くすることができる)。
- PCRチューブを65°C(または他の酵素特異的温度)で10〜15分間加熱することで、制限消化を不活性化します。
- 各PCRチューブから1%-2%のアガロースゲルの単一ウェルに反応全体をロードし、適切なバンド分離が達成されるまでゲルを110 mAで実行します。
注: アガロースゲルでの走行中に、可視化用に既に荷重染料が含まれている PCR ミックスを使用しています。この混合は、制限消化反応を妨げないので、一度に多くのワームをスクリーニングするために使用するのに便利です。
11. 積極的に編集されたワームを特定する
- DNAバンドサイズを検出するためにUV光(臭化エチジウムゲル用)の下でアガロースゲルを可視化します。
注:正に編集されたワームは、ワームゲノム内の所望の軌跡に制限部位を運ぶ修復テンプレートを使用して編集するため、期待されるサイズでDNAの余分なバンドを表示します。F1 ローラーワームは編集のためにヘテロ接数であることが予想されるため、3 つのバンド(1 つの野生型のノーカット PCR 産物と編集されたカット PCR 産物からの 2 つの小さなフラグメント)が表示されると予想されます。まれですが、ホモ接合が時折起こるのは注意が必要です。 - 編集の存在がサンガーシーケンシングによって確認されるまで、元の正に編集されたプレートをすべて保存します。
12. ホモザイゴス編集対象
- 各正に編集されたF1 Rolワームプレートから8〜12野生型の非ローリングF2ワームを選び、卵を産み、1〜2日間子孫を生成することができます。
注 :C.エレガンス は雌雄同体を自己受精しているので、編集されたアレルが生存率または発達に影響しない場合、予想されるホモ接合突然変異体の割合は約25%であるべきである。非ローリングF2 ワームは 、dpy-10 遺伝子座の野生型でなければなりません。非転動ワームを選ぶことは 、dpy-10(cn64) 突然変異を失い、目的の遺伝子でのみ突然変異を持つ編集されたワームの生成を可能にします。- なお 、dpy-10 遺伝子は染色体II上に存在する。あなたの関心のある遺伝子が dpy-10にリンクされている場合 、dpy-10 突然変異を目的の遺伝子から簡単に分離できない場合があります。
- 手順 9 ~ 11 を実行して、ホモ接合のワーム ラインを特定します。
13. シーケンスによる編集の確認
- ホモ接合性ワームが同定されたら、ステップ9で説明したように、ライシスおよびPCRを行う。
- 各ホモ接合ラインに対して少なくとも3つのPCR反応を配列化するように設定します。
- PCR精製キットを使用して PCR 反応を精製します。
- ナノドロップ分光光度計を用いてDNA濃度を測定する。
- サンガーシーケンシング用の各前方プライマーでサンプルを送信します。順次プライマーが、シーケンス処理する編集から少なくとも 50 基の距離になるように設計されていることを確認します。
- シーケンス解析ソフトウェアを使用してシーケンス結果を分析し、編集の有無を確認します。
Representative Results
rbm-3.2はヒト切断刺激因子サブユニット2タウ変異体に相同性を有する推定RNA結合タンパク質である(WormBase:https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10)。RBM-3.2タンパク質は、C.エレガンスセントリオイル複製の新しい調節因子としてこれらのタンパク質を同定した以前の研究でプロテインホスファターゼ1(GSP-1)とその調節剤阻害剤-2(I-2SZY-2)およびSDS-22の結合パートナーとして同定された(データは示されていない)45.現在、C.エレガンスにおけるrbm-3.2遺伝子の機能に関してはほとんど知られていない。したがって、C.エレガンスrbm-3.2遺伝子の生物学的役割をさらに調査するために、rbm-3.2-ヌル対立遺伝子rbm-3.2(ok688)は、カエノハブディティス遺伝学センター(CGC)から得られた。
残念ながら、rbm-3.2遺伝子全体の欠失を有することに加えて、rbm-3.2(ok688)対立遺伝子は重複する遺伝子rbm-3.1の部分的な欠失をもたらし、それによって遺伝子解析を複雑にする。そこで、C.エレガンスにおけるrbm-3.2遺伝子の役割を正確に調べるため、CRISPR/Cas9編集を使用して、C.エレガンスrbm-3.2コード領域の開始に非常に近い3つの早期停止コドンを導入し、重複するrbm-3.1遺伝子をそのまま残しました。
これらの早期停止コドンをC.エレガンスrbm-3.2遺伝子に導入するために、DNAの反対側の鎖(テンプレート鎖)に位置するPAMモチーフを有するcrRNAを設計した(図1A)。Cas9カットサイトは、rbm-3.2スタートコドンATGから6ベース離れた場所に位置していました。rbm-3.2遺伝子に早期停止コドンを導入するには、 私たちは、次の5つの主要な特性を持つ修復テンプレートを設計しました:1)rbm-3.2スタートコドン(左相同性アーム)2)PAMモチーフを含むベースの短いストレッチが削除されました3)スクリーニングのための開始コドンの直後にEcoRI制限サイトが導入されました 4) rbm-3.2.delete RBM-3.2 mRNA 5)第1イントロンへのrbm-3.2 mRNA 5)35塩基の第1イントロンへのrbm-3.2 mRNA5)の35塩基の翻訳を停止するために第5のRBM-3.2コドンの後に導入された3つのストップコドンが、編集の下流に含まれていた(右相同性アーム)(図1B)。
このCRISPR実験用の注入ミックスは、表Iに示すように調製した。注射ミックスを37°Cで15分間インキュベートし、リボヌクレオプロテイン複合体を組み立てた。その後、混合物を遠心分離し、引っ張られたマイクロインジェクション針に装填した。C.エレガンの生殖腺へのマイクロインジェクションは、201943.
図2は、このプロトコルを用いて編集された C.エレガンを 生成するための実験的なタイムラインを示しています。通常、CRISPR 実験ごとに 30 個のワームを注入しますが、一部のラボでは CRISPR 実験ごとに(10 ~ 20 の間で) より少ないワームを注入します。より多くのワームを注入すると、正の編集を見つける確率が高くなるため、より多くのワームを注入することを好みます。多くの研究所は、スクリーニングのために「ジャックポット」ブロード(50%以上のRolとDpy子孫を持つプレート)を選びます。いくつかのCRISPR実験を行った後の我々の経験では、大当たりの小化物が時折発生するが、大部分の時間、スクリーニングのために選ばれるRolワームは、多くの場合、いくつかのRolの子孫からなる多くの異なるP0 プレートから来る。この実験では大当たりの小木は得られない。
合計で、7つの注入されたP0ワームから得られた73F1ロルワームのゲノムDNAを編集の存在のためにスクリーニングした。rbm-3.2遺伝子の開始コドンに対するスクリーニングプライマーの配列およびそれらの位置を図3Aに示す。この分析を通じて、73 F1ワームのうち 7 個が編集に陽性であることが判明しました (図3B)。未編集のワームは、EcoRI消化時に445 bpの単一のDNA断片を表示した。一方、rbm-3.2遺伝子に早期停止コドンを運ぶワームは、EcoRI消化時にそれぞれ265bpおよび166bpの2つの断片を示した。ヘテロ接星編集ワームは、EcoRI消化時に3つの断片を表示した:445 bpの野生型未編集DNA断片1個と、rbm-3.2遺伝子の編集されたコピーからそれぞれ265 bpと166 bpの2つのDNA断片。
ホモ接合編集を行うワームを同定するために、同定された正のF1ヘテロジゴトから12F2ワームを新しい個々のプレートに移し、子孫を生成することを許可した(F3)。F2ワームは、先に述べたようにホモ接合性についてスクリーニングされた。12 個中 6 個 (50%) スクリーニングされたワームが、関心のある編集のためにホモ接合であることが判明しました(図 4A)。同定されたホモ接合性のワームラインのゲノムDNAを使用して、DNAシーケンシング反応を設定した。DNAシーケンシング解析では、そのホモ接合状態の編集の存在を確認しました(図 4B).一般に、複数のホモ接合ワームラインを配列して、すべてのホモ接合性のワームラインが同じ表現型を示すことを確認することが有益です(ヌル突然変異が特定の表現型を生成する場合)。また、ウェスタンブロッティングやRT-PCRなどの発現ベースのアッセイを用いて、または表現型解析を用いて遺伝子ノックアウトを検証することも必要な場合があります。これは、遺伝子の開始時に早期停止コドンを導入したにもかかわらず、早期停止コドンの下流に代替ATGが存在する可能性があるためである。このATGは、タンパク質発現を開始するために使用することができ、その結果、部分的に機能的な切り捨てられたタンパク質が生じる。
| 試薬 | 濃度 | 追加するボリューム |
| 20%グリセロールを含むヌクレアーゼフリー水中のCas9タンパク質 | 2 μg/μL | 5 μL |
| 5 mM トリス・クラム pH 7.5 のトラクルRNA | 4 μg/μL | 5 μL |
| dpy-10 crRNA 5 mM トリスCl pH 7.5 | 8 μg/μL | 0.4 μL |
| rbm-3.2 crRNA 5 mM トリスCl pH 7.5 | 8 μg/μL | 1 μL |
| dpy-10 無菌ヌクレアーゼフリー水の修復テンプレート | 500 ng/μL | 0.55 μL |
| rbm-3.2 無菌ヌクレアーゼフリー水の修復テンプレート | 1 μg/μL | 2.2 μL |
| 無菌ヌクレアーゼフリー水中のKCl | 1 M | 0.5 μL |
| 無菌ヌクレアーゼフリー水 | - | 5.35 μL |
表1:共CRISPRマーカーとしてリボヌクレオプロテイン複合体とdpy-10を用いたCRISPR/Cas9編集用の注入ミックスの成分。注射ミックスを作りながら、無菌技術とRNaseフリー試薬を使用してください。無菌、非DEPC処理ヌクレアーゼフリー水を使用して注入ミックスを行いました。
| 試薬 | 濃度 | 追加するボリューム |
| KCl | 1 M | 5 mL |
| トリス-HCl pH 8.3 | 1 M | 1 mL |
| MgCl2 | 1 M | 250 μL |
| NP-40 (または IGEPAL CA-630) | 100% | 450 μL |
| トゥイーン-20 | 100% | 450 μL |
| ゼラチン | 2% | 500 μL |
| 水 | - | 92.35 mL |
表2:ワームのリシスバッファレシピ ワームの溶出バッファーは、一括で作ることができ、オートクレーブ、フィルタリング、長期保存のために引用(注:溶岩バッファーは室温で1年以上保存することができます)。使用前に、1:10 mg/mLプロテイナーゼKをワーム溶解バッファーに1:100希釈します。
図1: rbm-3.2 早期停止CRISPRのcrRNAおよび修復テンプレート設計を示す回路図。A.テンプレート鎖上に位置するcrRNA配列およびPAMモチーフ配列を有するrbm-3.2遺伝子のコードおよびテンプレート鎖を表示する回路図。B. rbm-3.2遺伝子に3つの早期停止コドンを導入するために合成された修復テンプレートの異なる特性を表す回路図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:CRISPR/Cas9によるホモ接合編集C.エレガンスを生成するための実験的タイムラインは、組み立て済みリボヌクレオプロテイン複合体とdpy-10を共CRISPRマーカーとして用いた。CRISPR /Cas9編集のこの方法を使用してホモ接合編集C.エレガンスを生成するために実行する必要があるステップの日々の内訳。簡単に言えば、30のワームをマイクロインジェクションを使用してCRISPR編集ミックスを注入し、OP50大腸菌で播種した個々のMYOBプレートに分離した。24時間後、注射されたP0ワームを新鮮な新しいMYOBプレートに移し、卵を産み続けることを許した。マイクロインジェクションの3日目と4日目に、プレートにRol F1ワームの存在を調べた。ロルとDpy F1ワームの最大数を持つプレートが選択され、73 F1 Rolワーム(CRISPR実験ごとに50〜100 F1 Rolワームを選ぶ)を新しい個々のMYOBプレート(プレートあたり1ワーム)にシングルされ、約2日間卵を産むことができた。マイクロインジェクション後6日目に、前生を生じたF1ワーム(F2)からワームライセートを調製し、PCRによる編集の有無をスクリーニングし、その後EcoRIおよびアガロースゲル電気泳動による制限消化を行った。7日目、12の非ロル、非Dpy F2ワームを正のプレートから新しい個々のプレートに移し、子孫を生成させた(F3)。9日目に、F2ワームは、前述のように編集の均質性についてスクリーニングされた。10日目に、ホモ接合F3ワームに対してワームリシス、PCRおよびPCRクリーンアップを行い、ナノドロップ分光光度計を用いてDNA濃度を測定した。11日目、サンガーシーケンシング反応を陽性サンプルに対して設定し、DNAシーケンシングのために反応を送りました。12日目に、シーケンス結果を分析し、配列解析ソフトウェア(例えばCLCシーケンスビューア)を用いて編集の有無を検証した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: rbm-3.2早期停止コドンのヘテロ接合であるC.エレガンスのスクリーニングエコRIで消化したC.エレガンスゲノムPCR DNAのアガロースゲル電気泳動画像。73個のF1ワームを遺伝子型化し、rbm-3.2編集の存在をスクリーニングした。赤い数字とアスタリスクは、正に編集されたワームを示します。同定された7つのC.エレガンスは、EcoRI消化時にrbm-3.2遺伝子の編集コピーからそれぞれ445 bpの野生型未編集DNA断片1個と265bpおよび166bpの2つのDNA断片を示したため、編集のためのヘテロ接数であった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: rbm-3.2早期停止コドンを持つホモ接合編集C.エレガンスを同定し、検証する。A.rbm-3.2早期停止コドンのホモ接合体であるC.エレガンスのスクリーニング.EcoRIで消化されたC.エレガンスゲノムDNAのアガロースゲル電気泳動画像。陽性プレートから12個のF2ワームを遺伝子型化し、rbm-3.2編集の均質性についてスクリーニングした。赤:ホモ接合体編集ワーム。スクリーニングされた12のF2ワームのうち6つ(50%)はrbm-3.2早期停止コドンのホモ接合であった。ワーム7にPCR産物は存在しなかった。B.DNAシーケンシングによりrbm-3.2における早期停止コドンの挿入を確認する。未編集および編集されたホモ接合体のDNAおよびタンパク質配列の比較を示す図現図。ホモ接合体編集ワームからのゲノムDNAのDNAシーケンシング結果の分析により、CRISPR/Cas9編集時にrbm-3.2遺伝子に3つの早期停止コドンが存在することを確認した。CRISPR/Cas9編集後に得られたすべてのアミノ酸の変化は、赤い文字または赤いアスタリスクで示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
上記のプロトコルを使用して 、rbm-3.2 以外のいくつかの遺伝子を編集しました。異なる遺伝子座、ガイドRNA、修復テンプレート(一本鎖と二本鎖)の編集効率は2%から58%(データは表示されません)の間で変化しています。観察された編集効率は、このプロトコル27に対して、以前に報告された編集効率2%から70%に匹敵する。また、この手法を用いて遺伝子欠失を行う上でも成功を収めています。2つのcrRNAを使用して、6kbに近い遺伝子を緑色蛍光タンパク質(GFP)のコード配列に置き換えました(データは示されていません)。この実験では、解析されたRolF1 ワームの約14%がGFPによる遺伝子欠失および置換に陽性であることが判明した(データは示していない)。しかし、この技術を用いて行うことができる遺伝子欠失および置換の最大長を決定するために、追加の実験が必要である。
この方法を使用して、長さ約 1.6 KB の挿入を行うことができます。最近の研究では、このプロトコルを使用して長さが1.6 kbを超える挿入を行う場合、2つの二本鎖破断を生成し、より長い相同性アームを持つ修復テンプレートを使用すると、DNA(〜10Kb)28のはるかに大きな断片を挿入できることが示されています。あるいは、このプロトコルを用いた遺伝子編集の複数のラウンドを、より大きな編集を生成するために実行してもよい。他のプラスミドベースのC.エレガンスCRISPR/Cas9遺伝子編集プロトコルも、1.6kb46、47、48より大きいDNA断片の挿入を含むCRISPR実験に採用され得る。
遺伝子編集にこのプロトコルを使用する前に、目的の遺伝子が染色体IIのdpy-10遺伝子にリンクされていないことを確認する必要があります。標的遺伝子がdpy-10にリンクされている場合、dpy-10突然変異を目的の編集から分離することは問題になる可能性があります。したがって、対象遺伝子がdpy-10遺伝子座にリンクされている場合、unc-58(X染色体)、unc-22またはzen-4(染色体IV)、およびベン-1またはファ1(染色体III)(染色体III)などの他の共CRISPRマーカーを使用することができます。マイヤーラボのデータは、ben-1およびzen-4突然変異がこの方法28でスクリーニングするための成功した共CRISPRマーカーとして使用できることを実証する。しかし、zen-4とpha-1を共CRISPRマーカーとして使用すると、非野生型zen-4(cle10ts)またはpha-1(e2123ts)背景でそれぞれ26,28の背景でCRISPR実験を行う必要があることに注意することが重要です。また、ben-1のようないくつかのコCRISPRマーカーを含むCRISPR実験は、特別なプレート(例えばベンジミダゾールを含むプレート)28の調製を必要とするかもしれない。この方法を使用してdpy-10にリンクされている遺伝子の肯定的な編集をスクリーニングするために、unc-58コCRISPRマーカーを使用することに成功しました(データは示されていません)。unc-58(e665)突然変異は、正に編集されたワーム24をスクリーニングするために効果的に使用できる目に見える表現型(麻痺)を与える。あるいは、蛍光顕微鏡へのアクセスが可能な場合、蛍光タグ付きgtbp-1遺伝子も、このプロトコル19の共CRISPRマーカーとして使用することができる。
このゲノム編集方法を使用する場合の編集効率を高めるには、編集サイトがCas9切断部位から10~30塩基以内になければなりません。編集サイトがCas9切断部位から30拠点以上離れている場合、編集効率は19、35、37に大幅に低下します。しかし、マイヤーラボの最近の研究では、2つの二本鎖破断を互いに離れて作成することで、このプロトコル28を使用してCas9カットサイトから遠く離れた場所に編集を挿入できることが実証されています。
現在のプロトコルでは、修復テンプレートは、3つの挿入されたストップコドンがすべて同じ読み取りフレームに表示されるように設計されています。しかし、ヌル変異体を作成するための別の戦略は、前述の50を説明した普遍的な43塩基長いノックインSTOP-INカセットを使用することです。重要なことに、このカセットは、3つの可能な読み取りフレームすべてにコドンを停止させ、フレームシフト突然変異を引き起こす。これは、編集サイトで不適切な修復や不完全な修復が発生した場合にヌル突然変異体を生成する場合に特に便利な戦略です。
結論として、この方法の短い期間および最近の進歩のために、これは短い免疫原性エピトープタグ、蛍光タグ、遺伝子欠失、遺伝子置換およびコドン置換を加えることを含む日常的な実験室実験のための優れた方法である。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作品は、タルサ大学(TU)のスタートアップ資金と、ジョティ・イエールに授与されたTU教員育成サマーフェローシップによって支援されました。化学サマー学部研究プログラム(CSURP)とタルサ学部研究チャレンジ(TURC)に感謝申し上げます。キャロライン・ダンさんの技術支援を認めたい。最後に、ジョーダン・ウォード博士、エイミー・ジャラミロ=ランバート、アンナ・アレン、ロバート・シアフ、ウィリアム・ポッター、サイリ・モゲの批判的なコメントに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Barcoded DNA sequencing tubes | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Premixed | N/A |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01 | Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C |
| crRNAs | Horizon Discovery/ GE Dharmacon | N/A | Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C |
| EcoRI | New England Biolabs | R3101S | Stored at -30 °C |
| Minelute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | Spin columns stored at 4 °C |
| MyTaq Redmix | Meridian Bioscience | BIO-25043 | Stored at -30 °C |
| Primers | IDT | N/A | Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C |
| Proteinase K | Gold Bio | P-480-SL4 | Stored at -30 °C |
| Repair template oligos | IDT | N/A | 4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C |
| tracrRNA | Horizon Discovery/ GE Dharmacon | U-002005-50 | Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C |
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