Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

CRISPR/Cas9 Redigering av C. elegans rbm-3.2 Genen med dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker och monterade Ribonucleoprotein Complexes.

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/62001
Automatic Translation
1, *1, *1, *1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Tulsa
* These authors contributed equally

Summary

Målet med detta protokoll är att möjliggöra sömlös CRISPR/Cas9-redigering av C. elegans-genomet med hjälp av monterade ribonukleoproteinkomplex och dpy-10 co-CRISPR-markören för screening. Detta protokoll kan användas för att göra en mängd olika genetiska modifieringar i C. elegans inklusive infogningar, borttagningar, genersättningar och kodonersättning.

Abstract

Det bakteriella clustered regelbundet Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associerade protein (Cas) system har utnyttjats av forskare för att studera viktiga biologiskt relevanta problem. Den oöverträffade kraften i CRISPR/Cas genomredigeringsmetod gör det möjligt för forskare att exakt redigera valfri locus, vilket underlättar en ökad förståelse för genfunktionen. Flera metoder för att redigera C. elegans genomet av CRISPR/Cas9 har beskrivits tidigare. Här diskuterar och demonstrerar vi en metod som använder in vitro-monterade ribonukleoproteinkomplex och dpy-10 co-CRISPR-markören för screening. Specifikt, i den här artikeln, går vi igenom steg-för-steg-processen att införa förtida stoppkodon i C. elegans rbm-3.2-genen genom homologistyrd reparation med denna metod för CRISPR / Cas9-redigering. Denna relativt enkla redigeringsmetod kan användas för att studera funktionen hos alla genrer av intresse och möjliggör generering av homozygous-redigerad C. elegans genom CRISPR / Cas9-redigering på mindre än två veckor.

Introduction

Den klustrade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningen (CRISPR)/ Streptococcus pyogenes CRISPR-associerade protein (Cas) -tekniken möjliggör effektiv riktad genomredigering i ett brett spektrum av organismer1,2,3,4. CRISPR-systemet upptäcktes först som en del av ett prokaryota antivirala immunsvar5,6,7. Typ II CRISPR-systemet använder en endonukleas som Cas9, ett transaktiverande RNA (tracrRNA) och ett kort, mål DNA-specifikt 20-nukleotid långt styr CRISPR RNA (crRNA) för att känna igen ett "NGG" Protospacer Adjacent Motif (PAM) och göra en dubbelsträngad paus i mål-DNA5,6,7,8,9,10,11,12. Denna dubbelsträngade paus erkänns som en lesion av cellulära DNA reparation maskiner. Följaktligen kan den genererade dubbelsträngade pausen repareras av en av två vägar- i) Icke-homolog end joining (NHEJ) eller ii) Homology-riktad reparation (HDR)13. NHEJ är ofta felbenägen och därför, när denna väg används för att reparera den dubbelsträngade pausen i mål-DNA, orsakar det ofta inaktiverande mutationer (infogningar, borttagningar) i den gen som är av intresse. Å andra sidan, genom att förse en exogen reparationsmall med homologi till vardera sidan av dubbelsträngsbrottet, kan de cellulära DNA-reparationsmaskinerna riktas för att använda HDR för att reparera brott13. HDR-metoden möjliggör således exakt redigering av alla gräshoppor av intresse.

En mängd OLIKA CRISPR/ Cas9 genredigeringsprotokoll har beskrivits för C. elegans14,15,16,17,18,19,20. De vanligaste CRISPR / Cas9 redigeringsmetoderna i C. elegans inkluderar både kloningsbaserade och kloningsfria protokoll för att generera reparationsmallar för CRISPR / Cas9-redigering14,15,16,17,18,19,20. Detta protokoll diskuterar i detalj ett kloningsfritt CRISPR / Cas9-redigeringsprotokoll baserat på att använda dpy-10 som en co-CRISPR-markör för screening. Hittills använder det enda detaljerade C. elegans-fokuseradeCRISPR / Cas9-redigeringsvideoprotokollet som finns en fluorescerande markör för screening21. Att använda en fluorescerande markör för screening kräver dock tillgång till ett fluorescensmikroskop, som många laboratorier vid små främst grundutbildningsinstitutioner (PUI) kan ha svårt att komma åt. Det är uppmuntrande att notera att positiva korrelativa resultat har erhållits i tidigare studier mellan maskar som bär fluorescerande markörer och närvaron avredigeringen 21,22. Ytterligare studier är dock nödvändiga för att fastställa den övergripande effektiviteten hos den fluorescensbaserade screeningmetoden för redigering av en mängd olika lokus med olika guide RNAs och reparationsmallar. Slutligen, eftersom plasmiderna kodning för dessa fluorescerande markörer bildar extrakroosommatriser, produceras variabel fluorescens ofta från dessa matriser som kan göra positiva svårt att identifiera23. Även om den fluorescensbaserade screeningmetoden kan vara användbar att anta, kan de ovannämnda frågorna därför begränsa dess tillämplighet.

Att använda en co-CRISPR-markör som producerar en synlig fenotyp minskar kraftigt antalet avkomma som måste screenas för att hitta en positivt redigerad mask23,24,25,26,27,28. Viktigt är att fenotyperna som produceras av dessa markörer lätt kan detekteras under ett enkelt dissekerande mikroskop23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Dpy-10 co-CRISPR-markören är en av de bäst karakteriserade och allmänt använda co-CRISPR-markörerna för att utföra C. elegans CRISPR / Cas9 genomredigering24,27. Därför kommer den här artikeln att diskutera metoden att utföra CRISPR / Cas9-redigering i C. elegans med direkt leverans av ribonukleoproteinkomplex med dpy-10 som en co-CRISPR-markör27,35. I denna metod består den beredda redigering injektionsblandningen av en väl karakteriserad dpy-10 crRNA och dpy-10 reparation mall för att förmedla generationen av en observerbar dominerande "roller" (Rol) fenotyp som tilldelas av en känd heterozygous dpy-10 (cn64) mutation inom dpy-10 genen 24,27,29. När den finns i sitt homozygous tillstånd orsakar dpy-10(cn64) mutationen en dumpy (Dpy) fenotyp som producerar kortare och stouter maskar24,29. Rol fenotyp förmedlas av korrekt införande av den medföljande dpy-10 reparation mallen i en enda kopia av dpy-10 genen av HDR-medierad CRISPR /Cas9 redigering. Därför indikerar utseendet på Rol C. elegans en framgångsrik injektion samt en framgångsrik HDR-medierad redigeringshändelse i den injicerade maskens celler. Eftersom crRNA och reparationsmallen för målgenen av intresse är i samma injektionsblandning med dpy-10 crRNA och dpy-10 reparationsmall, finns det en god chans att de identifierade Rol maskarna också redigerades samtidigt vid målgenen av intresse. Därför screenas dessa Rol-maskar för redigering av intresse med tekniker som polymeraskedjereaktion (PCR) (för redigeringar större än 50 bp) eller av PCR följt av begränsningssammanfattning (för redigeringar mindre än 50 bp).

Fördelarna med att använda denna metod för genomredigering är: i) CRISPR-redigeringar kan genereras med en relativt hög effektivitet (2% till 70%) med denna metod27; ii) De reparationsmallar och riktlinje-RNAs som används i denna metod innebär inte kloning, vilket minskar den tid som krävs för deras generering. iii) Genom att montera ribonukleoproteinkomplex in vitrokan koncentrationerna i de monterade redigeringskomplexen bibehållas relativt konstant och därigenom förbättra reproducerbarheten. iv) vissa guide-RNAs som inte genererar redigeringar när de uttrycks från plasmider har visat sig fungera för CRISPR / Cas9 genomredigering när de levereras som in vitro transkriberade crRNAs27; v) inklusive dpy-10 co-CRISPR-markören möjliggör enkel screening med hjälp av ett dissekerande mikroskop och minskar antalet avkomma som måste screenas för att hitta positiva24,27; och vi) DNA-sekvensering verifierade homozygous-redigerade masklinjer kan erhållas med denna metod inom ett par veckor19,27.

Utmärkta bokkapitel som hänför sig till många olika C. elegans CRISPR-metoder har publicerats14,15,16,17,18,19,20,43. Demonstrationen av dpy-10 co-CRISPR-metoden i ett videoformat i laboratoriemiljö saknas dock för närvarande. I den här artikeln beskriver och demonstrerar vi processen att använda dpy-10 co-CRISPR-metoden för att redigera en representativ målgen som heter rbm-3.2, ett förmodat RNA-bindande protein (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10).  Specifikt beskriver vi här i detalj metoden att införa tre för tidiga stoppkodoner inom C. elegans rbm-3.2 genen med hjälp av in vitro-monterade ribonukleoproteinkomplex och en exogent levererad linjär enkelsträngad reparationsmall. Dessa studier har lyckats generera den första C. elegans CRISPR-stammen med för tidiga stoppkodoner i rbm-3.2-genen. Eftersom inte mycket för närvarande är känt om funktionen hos denna gen i C. elegans, kommer denna stam att fungera som ett användbart verktyg för att dissekera funktionen av RMB-3.2. Denna metod kan också antas för att göra infogningar, substitutioner och borttagningar vid alla gräshoppor inom C. elegans genomet.

Protocol

Detta protokoll för CRISPR/Cas9 genomredigering godkändes av University of Tulsa Institutional Biosafety Committee enligt NIH riktlinjer. Under hela detta protokoll praktiserades steril teknik. Alla steg i detta protokoll utfördes med reagenser som var fria från nukleaser. Särskild försiktighet togs för att förhindra RNase-förorening som rengöringshandskar samt arbetsytor och utrustning (t.ex. pipetter, utsidan av glas etc.) med en RNase dekontaminerande lösning.

1. crRNA-design

  1. Hitta PAM som gör att Cas9 kan klippa närmast redigeringsplatsen.
    1. PAM-webbplatsen är 5 '-NGG-3'.
    2. Kom ihåg att PAM kan vara på båda delarna av DNA: t.
  2. Välj 20 bp i slutet av PAM som crRNA-sekvens.
    OBS: Den faktiska crRNA-sekvensen som syntetiseras av kommersiella företag är längre än 20 bp eftersom den har en ytterligare generisk sekvens som automatiskt läggs till i den målspecifika 20 bp crRNA-sekvensen av syntetiseringsföretaget. När det gäller effekter utanför målet har nyligen genomförda studier inte funnit off-target effekter av Cas9 i C. elegans36,37,38,39,40. Dessutom är de resulterande CRISPR-redigerade stammarna överst. Därför är vi inte särskilt oroade över de utformade crRNAs effekter utanför målet. Onlinewebbplatser inklusive http://genome.sfu.ca/crispr/ och http://crispor.tefor.net/ kan dock användas för att hitta och välja crRNAs med minst off-target effekter38,41. crRNAs som slutar med en G eller GG och de med mer än 50% GC-innehåll förutspås vara effektivare19,23,42.
  3. Beställ minst 10 nmol crRNA från ett företag (t.ex. IDT, Horizon Discovery, etc.).
    1. När det lyofila crRNA anländer, lagra det vid -30 °C fram till dagen för mikroinjektionen.
    2. På dagen för utförandet av mikroinjektionen, snurra det lyofiliserade crRNA med maximal hastighet (17 000 x g) i en minut och återanvänd det i 5 mM Tris-Cl (pH 7,4) för att göra ett 8 μg/ μL-lager av crRNA.
    3. Förvara det oanvända crRNA-lagret fryst vid -80 °C.

2. Reparationsmalldesign

  1. Ladda ner en sekvensmanipulationsprogram (t.ex. CLC-sekvensvisare, APE, Snapgene, Vector NTI, etc.). Vi använder CLC sequence viewer version 8.0 (Qiagen) eftersom den är användarvänlig och kan laddas ner gratis.
  2. Klistra in sekvensen av mål-DNA av intresse i sekvensvisaren.
  3. Reparationsmallens orientering påverkar redigeringseffektiviteten28. För att föra in en reparationssekvens i PAM:s 5' ände, utforma en enkelsträngad reparationsmall med DNA-sekvens från samma DNA-sträng på vilken PAM-sekvensen är belägen (protospacersträng)28. När du sätter in en reparationssekvens i PAM:s 3" ände, utforma en enkelsträngad reparationsmall med DNA-sekvens från DNA-strängen som inte bär PAM-sekvensen (distanssträngen)28.
  4. Välj 35 baspar med oavbruten homologi på båda sidor (i slutet av 5' och 3" ) i redigeringen.
  5. Mutera eller ta bort PAM för att förhindra skärning av reparationsmallen eller det redigerade genomiska DNA:t från Cas9.
    1. Om mutation av PAM inte är möjligt, införa flera tysta mutationer nära 5' slutet av PAM för att förhindra skärning av reparation mallen eller den redigerade genomiska DNA.
    2. Se till att endast införa tysta mutationer av PAM om det finns i en exonic region.
    3. Kontrollera kodonanvändningsfrekvensen för att säkerställa att det muterade kodonet införs med en frekvens som är jämförbar med den ursprungliga icke-muterade kodon (t.ex. https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table). I vissa fall kanske det inte är möjligt att införa den muterade kodon med en liknande frekvens som den omuterade kodonet. Men för att göra mutationer av några aminosyror förväntar vi oss inte att uttrycksnivån för det mutanta proteinet kommer att ändras avsevärt.
  6. Om redigeringen är liten (t.ex. mutation av några baser), introducera en unik begränsningsplats nära redigeringen av tyst mutagenes. Vi använder http://heimanlab.com/cut2.html för att hitta begränsningsplatser som kan införas av tyst mutagenes.
    1. Kontrollera kodonanvändningsfrekvensen för att säkerställa att det muterade kodonet införs med en frekvens som är jämförbar med den ursprungliga icke-muterade kodon. Som nämnts ovan är detta inte alltid möjligt. Men för experiment som involverar mutationer av några aminosyror förväntar vi oss inte att uttrycksnivån för det muterade proteinet kommer att ändras avsevärt.
  7. Syntetisera och köp linjära enkelsträngade reparationsmallar för HDR som 4 nmol ultramer oligos.
  8. Återanvänd den lyofiliserade oligonukleotidreparationsmallen i nukleasfritt vatten för att göra ett 1 μg/μL lager av reparationsmallen och förvara den vid -30 °C tills den används vidare.

3. Screening primer design

  1. Med CLC-sekvensvisare eller andra liknande applikationer, designa 20 till 23 baspar framåt och omvända primers på vardera sidan av redigeringen, så att de producerar ett band på mellan 400 och 600 baspar vid PCR-förstärkning.
    1. För större insatser som är flera kilobaser i storlek, designa den främre primern som ska placeras strax utanför reparationsmallens vänstra homologiarm. Designa den omvända primern som ska placeras i själva reparationsmallen. I det här fallet kommer en PCR-produkt endast att erhållas vid positivt redigerade maskar.
    2. För att identifiera homozygous-redigerade maskar för längre infogningar, förstärk hela infogningsregionen genom att designa framåt- och omvända primers som finns utanför insättningskorsningarna.
  2. Testa primers och optimera PCR-förhållanden med genomiskt DNA av vild typ innan du använder primers för genotypning.
    1. Se till att ett enda band av förväntad storlek produceras vid PCR-förstärkning av genomiskt DNA (i förekommande fall).

4. Förbereda unga vuxna maskar för injektion

  1. Välj L2-L3 steg C. elegans på en färsk bakteriell gräsmatta på en MYOB-tallrik och inkubera vid 20 °C över natten.
    OBS: Protokollet för tillverkning av MYOB-plattor finns här: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/
  2. På dagen för mikroinjektion, välj unga vuxna maskar med färre än 10 embryon i livmodern att injicera.

5. Förbereda injektionsblandningen

  1. Förbered injektionsblandningen i samma ordning som visas i tabell 1 i sterila nukleasfria rör.
    OBS: Komponenterna i injektionsblandningen kan skalas ner för att göra 5 μL injektionsblandningar (istället för 20 μL) om framtida injektioner med denna blandning inte förväntas.
  2. Blanda injektionsblandningen genom pipetting.
  3. Inkubera injektionsblandningen vid 37 °C i 15 minuter för att montera ribonukleoproteinkomplex.
  4. Snurra injektionsblandningen vid 4 °C vid 17 000 x g i 5 minuter.

6. Mikroinjektion i C. elegans gonad

  1. Utför mikroinjektion av CRISPR-injektionsblandningen i C. elegans gonad, enligt beskrivningen i Iyer et al. 201943.
    1. Injicera ett 30-tal maskar med CRISPR-injektionsblandning. Den oanvända injektionsblandningen kan återanvändas genom förvaring vid 4 °C under en period av ca 6 månader utan effektivitetsförlust49.
    2. Injicera båda gonadarmarna om möjligt. Injicerade maskar anses vara P0-generationen.

7. Injicerad maskåterhämtning och överföring

  1. Efter mikroinjektion, flytta de mikroinjekterade P0-maskarna med hjälp av en maskplockning till en 60 mm MYOB-agarplatta sådd med OP50 E. coli och låt dem återhämta sig vid rumstemperatur i ungefär en timme.
    1. Observera att återhämtningstemperaturen beror på genotypen för de injicerade maskarna. Till exempel, för temperaturkänsliga stammar kan maskåtervinning vid en annan temperatur vara nödvändig.
  2. Använd en platinatrådmaskplockning, överför varje injicerad mask till en enda sådd 35 mm MYOB agar petriplatta och låt dem lägga ägg vid 20 °C till nästa dag.
    1. Observera att vissa maskar kommer att dö till följd av skada från mikroinjektionsproceduren. Välj bara maskarna som lever och uppvisa rörelse.
  3. Efter 24 timmar överför du de injicerade maskarna till nya enskilda plattor (1 mask per tallrik).

8. Plockning C. elegans för screening

  1. 3 till 4 dagar vid 20°C efter injektionen utfördes, övervaka alla plattor som innehåller avkomman till de injicerade maskarna med hjälp av ett dissekerande mikroskop.
  2. Identifiera plattor som har F1 avkomma uppvisar rulle (Rol) och dumpy (Dpy) fenotyper. En Dpy fenotyp är där maskar verkar kortare och stouter än kontrollmaskar i samma utvecklingsstadium (WormBase: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0--10). Plattor med Rol och Dpy maskar representerar plattor där F1 avkomma har framgångsrikt redigerats med dpy-10 (cn64) mutationen att vara närvarande i dess heterozygous eller homozygous tillstånd, respektive.
  3. Välj tallrikarna med de mest rull- och dumpy maskarna för screening.
  4. Peka ut 50 till 100 F1 Rol maskar från dessa tallrikar till sina egna enskilda plattor (1 mask per tallrik) och låt dem lägga ägg.
    1. Låt L4-iscensatta F1 Rol-maskar lägga ägg och producera avkomma (F2)i 1 till 2 dagar.

9. Enkelmasklys och PCR

  1. Efter att ha producerat F2 i 1 till 2 dagar, överför varje singled F1 Rol mor till 2,5 μL lysbuffert (tabell 2) med en utspädning på 1:100 av 20 mg/mL Proteinas K.
  2. Frys rören vid -30 °C i 20 minuter. Maskarna kan lagras i detta skede under en längre period tills vidare analys.
  3. Utför en masklysning på en PCR-termocyklist med följande förhållanden: 60 °C i 1 timme, 95 °C i 15 min och håll vid 4 °C.
  4. Tillsätt följande reagenser direkt till 2,5 μL av lysmasken som innehåller PCR-rör: 12,5 μL 2x PCR-blandning som innehåller dNTP, DNA-polymeras, MgCl2 och lastfärg, 1 μL 10 μM framåt primer, 1 μL 10 μM omvänd primer och sterilt vatten till 22,5 μL. Den totala volymen för varje PCR-reaktion är 25 μL.
    OBS: Vid screening av flera F1-maskar är det snabbare och bekvämare att göra en PCR-master-mix för flera reaktioner och lägga till 22,5 μL av master-mixen till varje lysisrör.
  5. Ställ in PCR-reaktioner på en termocyklist med följande förhållanden: 95 °C i 1 minut, 35 cykler på 95 °C för 15 s, 55 °C för 15 s (optimera för varje primeruppsättning), 72 °C i 1 minut (optimera för varje mål-DNA)44. Håll reaktionerna vid 4 °C.

10. Begränsning av matsmältningen och agarose gel elektrofores

OBS: En begränsningssammanfattning är endast nödvändig vid screening för små redigeringar (mindre än 50 bp).

  1. Överför 10 μL PCR-DNA från steg 9 till ett nytt rör.
  2. Tillsätt mellan 2 till 4 enheter restriktionsenzym och 1x begränsningsenzymbuffert (1,5 μL 10x reaktionsbuffert) per 15 μL reaktion.
  3. Inkubera vid 37 °C (eller vid annan enzymspecifik temperatur) i 2 timmar (kortare inkubationstider kan vara möjliga med snabbverkande enzymer).
  4. Värme inaktiverar begränsningssammanfattningen genom att värma PCR-rören vid 65 °C (eller annan enzymspecifik temperatur) i 10 till 15 minuter.
  5. Ladda hela reaktionen från varje PCR-rör i en enda brunn på en 1-2% agarosgel och kör gel vid 110 mA tills korrekt bandseparation uppnås.
    OBS: Vi använder en PCR-blandning som redan har ett lastfärgämne inkluderat för visualisering medan vi körs på en agarose gel. Denna blandning stör inte begränsningen av matsmältningsreaktionen och är därför bekväm att använda för screening av många maskar på en gång.

11. Identifiera positivt redigerade maskar

  1. Visualisera agarosageler under UV-ljus (för ethidiumbromidgeler) för att upptäcka DNA-bandstorlekar.
    OBS: Positivt redigerade maskar kommer att visa ett extra DNA-band i förväntad storlek på grund av redigering med hjälp av reparationsmallen som bär begränsningsplatsen vid önskad locus i maskgenomet. F1 rullmaskar förväntas vara heterozygous för redigeringen och förväntas därför uppvisa tre band (en vild typ oklippt PCR-produkt och två mindre fragment från den redigerade skurna PCR-produkten). Även om det är sällsynt, måste det noteras att homozygoter uppstår ibland.
  2. Spara alla ursprungliga positivt redigerade plattor tills redigeringens närvaro verifieras av Sanger-sekvensering.

12. Homozygose redigering av intresse

  1. Välj mellan 8 och 12 vilda typ ser icke-rullande F2 maskar från respektive positivt redigerade F1 Rol maskplattor och låt dem lägga ägg och producera avkomma i 1 till 2 dagar.
    OBS: Eftersom C. elegans är självbefruktande hermafroditer, om den redigerade allelen inte påverkar livskraften eller utvecklingen, bör andelen förväntade homozygous mutanter vara cirka 25%. Icke-rullande F2-maskar måste vara vilda för dpy-10-locus. Att plocka icke-rullande maskar möjliggör generering av redigerade maskar som har förlorat dpy-10 (cn64) mutationen och bara har mutationen vid din gen av intresse.
    1. Observera att dpy-10 genen är närvarande på kromosom II. Om din gen av intresse är kopplad till dpy-10, kanske du inte lätt kan separera dpy-10 mutationen bort från din gen av intresse.
  2. Utför steg 9 till och med 11 för att identifiera homozygösa masklinjer.

13. Bekräfta redigering genom sekvensering

  1. När homozygous maskar har identifierats, utför lysis och PCR enligt beskrivningen i steg 9.
    1. Ställ in minst 3 PCR-reaktioner för varje homozygous linje som ska sekvenseras.
  2. Rena PCR-reaktionerna med hjälp av ett PCR-reningskit.
  3. Mät DNA-koncentrationen med hjälp av en nanodroppspektrofotometer.
  4. Skicka prov med respektive framåtriktad primer för Sanger-sekvensering. Se till att den främre primern är utformad för att vara minst 50 baser bort från redigeringen som ska sekvenseras.
  5. Analysera sekvenseringsresultaten med hjälp av sekvensanalysprogramvara för att bekräfta förekomsten av redigeringen.

Representative Results

rbm-3.2 är ett förhöjande RNA-bindande protein som har homologi till mänsklig klyvningsstimulering faktor underavdelning 2 tau variant (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). RBM-3.2-proteinet identifierades som en bindande partner till Protein Phosphatase 1 (GSP-1) och dess regulatorer Inhibitor-2 (I-2SZY-2) och SDS-22 i en tidigare studie som identifierade dessa proteiner som nya regulatorer av C. elegans centriole duplicering (data visas inte)45. För närvarande är mycket lite känt om funktionen hos rbm-3.2 genen i C. elegans. Därför, för att ytterligare undersöka den biologiska rollen av C. elegans rbm-3.2 genen, erhölls rbm-3.2-null allel rbm-3.2 (ok688) från Caenorhabditis Genetics Center (CGC).

Tyvärr, förutom att ha en borttagning av hela rbm-3.2 genen, rbm-3.2 (ok688) allelen resulterar också i en partiell borttagning av en överlappande gen, rbm-3.1, vilket komplicerar genetisk analys. För att noggrant undersöka rbm-3.2-genens roll i C. elegans använde vi därför CRISPR/Cas9-redigering för att införa tre för tidiga stoppkodon mycket nära början av C. elegans rbm-3.2-kodningsregionen, vilket lämnade den överlappande rbm-3.1-genen intakt.

För att introducera dessa för tidiga stoppkodoner i C. elegans rbm-3.2-genen designade vi ett crRNA med ett PAM-motiv som låg på motsatt sträng (mallsträng) av DNA ( Figur1A). Cas9-skärplatsen var belägen 6 baser bort från rbm-3.2 start codon ATG. För att införa förtida stoppkodon i rbm-3.2-genen, Vi utformade en reparationsmall med följande fem huvudegenskaper: 1) 35 baser av oavbruten homologi till rbm-3.2 uppströms rbm-3.2 startkodon (vänster homologiarm) 2) En kort bassträcka som innehåller PAM-motivet togs bort 3) En EcoRI-begränsningsplats infördes omedelbart efter starten kodon för screening 4) Den andra och den tredje kodon av rbm-3.2 togs bort och tre stoppkodon infördes efter den femte RBM-3.2 kodon för att stoppa översättningen av rbm-3,2 mRNA 5) 35 baser av oavbruten homologi till den första intronen av rbm-3.2 inkluderades nedströms redigeringen (höger homologiarm) ( Figur1B).

Injektionsblandningen för detta CRISPR-experiment har beretts enligt tabell I. Injektionsblandningen inkuberades vid 37 °C i 15 minuter för att montera ribonukleoproteinkomplex. Blandningen centrifugerades sedan och laddades i den dragna mikroinjektionsnålen. Mikroinjektion i C. elegansgonad utfördes enligt beskrivningen i Iyer et al. 201943.

Figur 2 visar den experimentella tidslinjen för att generera redigerad C. elegans med hjälp av detta protokoll. Även om vi vanligtvis injicerar 30 maskar för varje CRISPR-experiment, injicerar vissa laboratorier färre maskar (mellan 10 och 20) för varje CRISPR-experiment. Eftersom injicera fler maskar ökar sannolikheten för att hitta positiva redigeringar föredrar vi att injicera ett större antal maskar. Många laboratorier väljer "jackpot" kullar (tallrikar med mer än 50% Rol och Dpy avkomma) för screening. Enligt vår erfarenhet efter att ha utfört flera CRISPR-experiment, även om jackpot grubblar uppstår ibland, kommer de flesta gånger Rol-maskarna som plockas för screening ofta från många olika P0-plattor, som var och en består av några Rol-avkomma. Inga jackpott grubblar erhölls i detta experiment.

Totalt screenade vi genomiskt DNA av 73 F1 Rol maskar som erhölls från 7 injicerade P0 maskar för närvaron av redigeringen. Sekvenserna av screeningprimrarna och deras placeringar med avseende på startkodonet för genen rbm-3.2 är representerade i figur 3A. Genom vår analys konstaterades att 7 av 73 F1-maskar var positiva för redigeringen (9,5%) ( Figur3B). Oredigerade maskar visade ett enda DNA-fragment på 445 bp vid EcoRI matsmältning. Maskar som bar på en för tidig stop codon i genen rbm-3.2 uppvisade två fragment på 265 bp respektive 166 bp vid EcoRI-matsmältningen. Heterozygous-redigerade maskar visade tre fragment på EcoRI matsmältning: en vild-typ oredigerade DNA fragment av 445 bp och två DNA fragment av 265 bp respektive 166 bp från den redigerade kopian av rbm-3.2 genen.

För att identifiera maskar som bär homozygous redigeringar överförde vi 12 F2-maskar från de identifierade positiva F 1-heterozygoterna på nya enskilda plattor och tillät dem att producera avkomma (F3). F2-maskarna screenades sedan för homozygositet som beskrivits tidigare. 6 av 12 (50%) screenade maskar befanns vara homozygous för vår redigering av intresse (Figur 4A). Genomiskt DNA från en identifierad homozygous-redigerad mask linje användes för att ställa in en DNA-sekvensering reaktion. DNA-sekvenseringsanalys bekräftade förekomsten av redigeringen i dess homozygous tillstånd (Figur 4B). I allmänhet är det fördelaktigt att sekvensera flera homozygous masklinjer för att säkerställa att alla homozygous-redigerade masklinjer uppvisar samma fenotyp (om null-mutationen producerar en specifik fenotyp). Vidare kan det också vara nödvändigt att validera gen knockouts med hjälp av en uttrycksbaserad analys såsom western blotting eller RT-PCR eller via fenotyp analys. Detta beror på att det är möjligt att trots att man inför för tidigt stoppkodon i början av genen, kan en alternativ ATG vara närvarande nedströms de för tidiga stoppkodonerna. Denna ATG kan användas för att initiera proteinuttryck, vilket resulterar i ett delvis funktionellt trunkerat protein.

Reagens Koncentration Volym att lägga till
Cas9-protein i nukleasfritt vatten med 20% glycerol 2 μg/μL 5 μL
tracrRNA i 5 mM Tris-Cl pH 7,5 4 μg/μL 5 μL
dpy-10 crRNA i 5 mM Tris-Cl pH 7,5 8 μg/μL 0,4 μL
rbm-3,2 crRNA i 5 mM Tris-Cl pH 7,5 8 μg/μL 1 μL
dpy-10 reparationsmall i sterilt nukleasfritt vatten 500 ng/μL 0,55 μL
rbm-3.2 reparationsmall i sterilt nukleasfritt vatten 1 μg/μL 2,2 μL
KCl i sterilt nukleasfritt vatten 1 M 0,5 μL
sterilt nukleasfritt vatten - 5,35 μL

Tabell 1: Komponenter i injektionsblandningen för CRISPR/Cas9-redigering med ribonukleoproteinkomplex och dpy-10 som co-CRISPR-markör. Använd sterila tekniker och RNase-fria reagenser medan du gör injektionsblandningen. Observera att sterilt, icke-DEPC-behandlat nukleasfritt vatten användes för att göra injektionsblandningen.

Reagens Koncentration Volym att lägga till
KCl (kcl) 1 M 5 ml
Tris-HCl pH 8,3 1 M 1 ml
MgCl2 (olika) 1 M 250 μL
NP-40 (eller IGEPAL CA-630) 100% 450 μL
Interpolering-20 100% 450 μL
Gelatin 2% 500 μL
Vatten - 92,35 ml

Tabell 2: Worm lysis buffertrecept. Masklysbufferten kan tillverkas i bulk, autoklaveras, filtreras och alikvoteras för långtidslagring (OBS: lysbufferten kan lagras i över ett år vid rumstemperatur). Tillsätt en utspädning på 1:100 på 20 mg/ml proteinas K till masklysbufferten strax före varje användning.

Figure 1
Bild 1: Schematisk visning av crRNA och reparationsmalldesign för rbm-3.2 förtida stopp CRISPR. A. Schematisk visning av kodnings- och mallsträngarna i rbm-3.2-genen med crRNA-sekvensen och PAM-motivsekvensen som finns på mallsträngen. B. Schematisk representerar de olika egenskaperna hos reparation mall som syntetiserades för att införa tre för tidigt stopp kodoner i rbm-3.2 genen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Experimentell tidslinje för att generera homozygous-redigerad C. elegans genom CRISPR/Cas9-redigering med förmonterade ribonukleoproteinkomplex och dpy-10 som co-CRISPR-markör. En dag-för-dag uppdelning av stegen som måste utföras för att generera homozygous-redigerad C. elegans med denna metod för CRISPR / Cas9 redigering. Kort, 30 maskar injicerades med CRISPR redigering blandning med mikroinjektion och segregeras på enskilda MYOB plattor sådd med OP50 E. coli. Efter 24 timmar överfördes de injicerade P0-maskarna på färska nya MYOB-plattor och tilläts fortsätta lägga ägg. På dag 3 och 4 efter microinjection undersöktes plattorna för förekomsten av Rol F1 maskar. Plattorna med det maximala antalet Rol- och Dpy F1-maskar valdes och 73 F1 Rol-maskar (vi brukar välja mellan 50 och 100 F1 Rol-maskar per CRISPR-experiment) pekades ut på nya enskilda MYOB-plattor (1 mask per tallrik) och fick lägga ägg i ca 2 dagar. På dag 6 efter microinjection, mask lysates förbereddes från F1 maskar som hade producerat avkomma (F2) och screenades för förekomsten av redigering av PCR följt av begränsning matsmältning med EcoRI och agarose gel elektrofores. På dag 7, 12 icke-Rol, icke-Dpy F2 maskar överfördes från de positiva plattorna till nya enskilda plattor och tilläts producera avkomma (F3). På dag 9 screenades F2-maskarna för homozygositet av redigeringen som beskrivits tidigare. På dag 10 utfördes masklysning, PCR och PCR-rengöring för de homozygous F3-maskarna och DNA-koncentrationen mättes med hjälp av en NanoDrop-spektrofotometer. På dag 11 sattes Sanger sekvenseringsreaktioner upp för positiva prover och reaktionerna skickades för DNA-sekvensering. På dag 12 analyserades sekvenseringsresultaten och förekomsten av redigeringen verifierades med hjälp av en sekvensanalysprogramvara (t.ex. CLC-sekvensvisare). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Screening för C. elegans som är heterozygous för rbm-3.2 för tidigt stopp kodoner. Agarose gel elektrofores bilder av C. elegans genomisk PCR DNA smält med EcoRI. 73 enskilda F1 maskar var genotyped och screened för förekomsten av rbm-3.2 redigering. Röda siffror och asterisker indikerar positivt redigerade maskar. Alla de 7 identifierade positivt redigerade C. elegans var heterozygous för redigeringen som de uppvisade en vild typ oredigerade DNA fragment av 445 bp och två DNA fragment av 265 bp respektive 166 bp från den redigerade kopian av rbm-3.2 genen på EcoRI matsmältning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Identifiera och verifiera homozygous-redigerad C. elegans som bär rbm-3.2 för tidigt stoppkodon. A. Screening för C. elegans som är homozygous för rbm-3.2 för tidigt stopp kodoner. Agarose gel elektrofores bilder av C. elegans genomiskt DNA smält med EcoRI. 12 enskilda F2 maskar från positiva plattor genotypade och screenade för homozygosity av rbm-3.2 redigering. Röd: homozygous-redigerade maskar. 6 av de 12 screenade F2 maskarna (50%) var homozygous för rbm-3.2 för tidigt stopp kodoner. Ingen PCR-produkt fanns för mask 7. B. Jag är inte så bra på Bekräfta införandet av de för tidiga stoppkodonerna i rbm-3.2 genom DNA-sekvensering. Schematiskt visar jämförelsen av DNA och proteinsekvenser av oredigerade och redigerade homozygoter. Analys av DNA-sekvensering resultat av genomisk DNA från homozygous-redigerade maskar bekräftade förekomsten av de tre för tidigt stopp kodoner i rbm-3.2 genen vid CRISPR/Cas9 redigering. Alla resulterande aminosyra förändringar efter CRISPR/Cas9 redigering anges i antingen röda bokstäver eller röda asterisker. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Discussion

Vi har använt ovanstående protokoll för att redigera flera gener förutom rbm-3.2. Våra redigeringseffektiviteter för olika lokus, guide RNAs och reparationsmallar (enkelsträngade och dubbelsträngade) har varierat mellan 2% och 58% (data visas inte). De observerade redigeringseffektiviteterna är jämförbara med de tidigare rapporterade redigeringseffektiviteterna på 2% till 70% för detta protokoll27. Vi har också lyckats använda denna teknik för att göra genborttagningar. Med hjälp av två crRNAs ersatte vi en gen som är nära 6 kb lång med kodningssekvensen för grönt fluorescerande protein (GFP) (data som inte visas). För detta experiment befanns cirka 14% av de Rol F1-maskar som analyserades vara positiva för genborttagning och ersättning med GFP (data som inte visas). Ytterligare experiment krävs dock för att bestämma den maximala längden på genborttagningar och ersättningar som kan utföras med denna teknik.

Denna teknik kan användas för att göra infogningar som är ca 1,6 kb långa19. En ny studie har visat att för att göra infogningar som är över 1,6 kb långa med detta protokoll, generera två dubbelsträngsbrytningar och använda reparationsmallar med längre homologiarmar kan möjliggöra införandet av mycket större fragment av DNA (~ 10 Kb)28. Alternativt kan flera omgångar av genredigering med detta protokoll utföras för att generera större redigeringar. Andra plasmidbaserade C. elegans CRISPR/Cas9-genredigeringsprotokoll kan också antas för CRISPR-experiment som inbegriper införande av DNA-fragment större än 1,6 kb46,47,48.

Innan du använder detta protokoll för genredigering är det nödvändigt att säkerställa att genen av intresse inte är kopplad till dpy-10 locus på kromosom II. Om en målgen är kopplad till dpy-10kan det vara problematiskt att separera dpy-10-mutationen bort från din redigering av intresse. Därför, i händelse av att genen av intresse är kopplad till dpy-10 locus, Andra co-CRISPR-markörer såsom unc-58 (X-kromosom),unc-22 eller zen-4 (kromosom IV)och ben-1 eller pha-1 (kromosom III) som ligger på olika kromosomer får användas24,25,26,28. Data från Meyer lab visar att ben-1 och zen-4 mutationer kan användas som framgångsrika co-CRISPR markörer för screening med denna metod28. Det är dock viktigt att notera att användning av zen-4 och pha-1 som co-CRISPR-markörer kräver att CRISPR-experimentet i icke-vilda zen-4(cle10ts) respektive pha-1(e2123ts) bakgrunder26,28. Crispr-experiment med vissa co-CRISPR-markörer som ben-1 kan dessutom kräva beredning av specialplattor (t.ex. plattor som innehåller bensimidazol)28. Vi har framgångsrikt använt unc-58 co-CRISPR-markören för att screena för positiva redigeringar för en gen som är kopplad till dpy-10 med den här metoden (data visas inte). Unc-58(e665) mutationen ger en synlig fenotyp (förlamning) som effektivt kan användas för att screena för positivt redigerade maskar24. Alternativt, om tillgång till ett fluorescerande mikroskop finns tillgängligt, kan en fluorescerande märkt gtbp-1-gen också användas som co-CRISPR-markör för detta protokoll19.

För en hög redigeringseffektivitet när du använder den här metoden för genomredigering måste redigeringswebbplatsen vara inom 10 till 30 baser från Cas9-skärplatsen. Om redigeringswebbplatsen är över 30 baser bort från Cas9-skärplatsen sjunker redigeringseffektivitetendrastiskt 19,35,37. En ny studie från Meyer-labbet har dock visat att skapa två dubbelsträngsbrytningar på avstånd från varandra kan möjliggöra införandet av redigeringar långt borta från Cas9-skärplatsen med hjälp av detta protokoll28.

I det aktuella protokollet utformades reparationsmallen så att alla tre infogade stoppkodon visas i samma läsram. En alternativ strategi för att skapa null-mutanter skulle dock vara att använda en universell 43-baser lång knock-in STOP-IN kassett som har beskrivits tidigare50. Viktigt är att denna kassett har stoppkodon i alla de tre möjliga läsramarna och orsakar frameshift mutationer. Detta är en särskilt användbar strategi för att generera null-mutanter när felaktig eller ofullständig reparation sker på redigeringsplatsen.

Sammanfattningsvis, på grund av dess korta varaktighet och de senaste framstegen inom denna metod, är detta en utmärkt metod för rutinmässiga laboratorieexperiment som involverar tillsats av korta immunogena epitoptaggar, fluorescerande taggar, gör genborttagningar, genersättningar och kodonersättning.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Start-up-medel från University of Tulsa (TU) och TU Faculty Development Summer Fellowship som tilldelades Jyoti Iyer. Vi vill tacka Kemisommaren Grundutbildningsprogrammet (CSURP) och Tulsa Undergraduate Research Challenge (TURC) för att ha tilldelat stipendier till de studenter som deltar i denna studie. Vi vill tacka caroline Dunn för hennes tekniska hjälp. Slutligen vill vi tacka Drs. Jordan Ward, Aimee Jaramillo-Lambert, Anna Allen, Robert Sheaff, William Potter och Saili Moghe för deras kritiska kommentarer om detta manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Barcoded DNA sequencing tubes Eurofins Genomics SimpleSeq Kit Premixed N/A
Cas9 protein PNA Bio CP01 Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C
crRNAs Horizon Discovery/ GE Dharmacon N/A Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C
EcoRI New England Biolabs R3101S Stored at -30 °C
Minelute PCR purification kit Qiagen 28004 Spin columns stored at 4 °C
MyTaq Redmix Meridian Bioscience BIO-25043 Stored at -30 °C
Primers IDT N/A Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
Proteinase K Gold Bio P-480-SL4 Stored at -30 °C
Repair template oligos IDT N/A 4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
tracrRNA Horizon Discovery/ GE Dharmacon U-002005-50 Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  2. Carroll, D. Genome engineering with targetable nucleases. Annual Review of Biochemistry. 83, 409-439 (2014).
  3. Chandrasegaran, S., Carroll, D. Origins of Programmable Nucleases for Genome Engineering. Journal of Molecular Biology. 428 (5), 963-989 (2016).
  4. Knott, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361 (6405), 866-869 (2018).
  5. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  6. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
  7. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  8. Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Almendros, C. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology. 155 (3), 733-740 (2009).
  9. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  10. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 2579-2586 (2012).
  11. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  12. Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and classification of CRISPR-Cas systems. CRISPR, Methods in Molecular Biology. 1311, Humana Press. New York, NY. 7-75 (2015).
  13. Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
  14. Frøkjær-Jensen, C. Exciting prospects for precise engineering of Caenorhabditis elegans genomes with CRISPR/Cas9. Genetics. 195 (3), 635-642 (2013).
  15. Waaijers, S., Boxem, M. Engineering the Caenorhabditis elegans genome with CRISPR/Cas9. Methods. 68 (3), 381-388 (2014).
  16. Xu, S. The application of CRISPR-Cas9 genome editing in Caenorhabditis elegans. Journal of Genetics and Genomics. 42 (8), 413-421 (2015).
  17. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-based methods for Caenorhabditis elegans genome engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  18. Nance, J., Frøkjær-Jensen, C. The Caenorhabditis elegans transgenic toolbox. Genetics. 212 (4), 959-990 (2019).
  19. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. 121, 86-93 (2017).
  20. Kim, H. M., Colaiácovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in Caenorhabditis elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 106 (2019).
  21. Prior, H., MacConnachie, L., Martinez, J. L., Nicholl, G. C., Beg, A. A. A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins. Journal of Visualized Experiments. (134), e57518 (2018).
  22. Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly efficient, rapid and Co-CRISPR-independent genome editing in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (11), 3693-3698 (2017).
  23. Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
  24. Arribere, J. A., Bell, R. T., Fu, B. X., Artiles, K. L., Hartman, P. S., Fire, A. Z. Efficient marker-free recovery of custom genetic modifications with CRISPR/Cas9 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (3), 837-846 (2014).
  25. Kim, H., et al. A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).
  26. Ward, J. D. Rapid and precise engineering of the Caenorhabditis elegans genome with lethal mutation co-conversion and inactivation of NHEJ repair. Genetics. 199 (2), 363-377 (2015).
  27. Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).
  28. Farboud, B., Severson, A. F., Meyer, B. J. Strategies for efficient genome editing using CRISPR-Cas9. Genetics. 211 (2), 431-457 (2019).
  29. Levy, A. D., Yang, J., Kramer, J. M. Molecular and genetic analyses of the Caenorhabditis elegans dpy-2 and dpy-10 collagen genes: a variety of molecular alterations affect organismal morphology. Molecular Biology of the Cell. 4 (8), 803-817 (1993).
  30. Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55 (4), 555-565 (1988).
  31. Schnabel, H., Schnabel, R. An organ-specific differentiation gene, pha-1, from Caenorhabditis elegans. Science. 250 (4981), 686-688 (1990).
  32. Granato, M., Schnabel, H., Schnabel, R. pha-1, a selectable marker for gene transfer in C. elegans. Nucleic Acids Research. 22 (9), 1762-1763 (1994).
  33. Chalfie, M., Thomson, J. N. Structural and functional diversity in the neuronal microtubules of Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 93 (1), 15-23 (1982).
  34. Severson, A. F., Hamill, D. R., Carter, J. C., Schumacher, J., Bowerman, B. The aurora-related kinase AIR-2 recruits ZEN-4/CeMKLP1 to the mitotic spindle at metaphase and is required for cytokinesis. Current Biology. 10 (19), 1162-1171 (2000).
  35. Paix, A., Schmidt, H., Seydoux, G. Cas9-assisted recombineering in C. elegans: genome editing using in vivo assembly of linear DNAs. Nucleic Acids Research. 44 (15), 128 (2016).
  36. Chiu, H., Schwartz, H. T., Antoshechkin, I., Sternberg, P. W. Transgene-free genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas. Genetics. 195 (3), 1167-1171 (2013).
  37. Paix, A., et al. Scalable and versatile genome editing using linear DNAs with microhomology to Cas9 Sites in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1347-1356 (2014).
  38. Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
  39. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nature Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
  40. Friedland, A. E., Tzur, Y. B., Esvelt, K. M., Colaiácovo, M. P., Church, G. M., Calarco, J. A. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
  41. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  42. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PloS One. 9 (5), e98186 (2014).
  43. Iyer, J., DeVaul, N., Hansen, T., Nebenfuehr, B. Using microinjection to generate genetically modified Caenorhabditis elegans by CRISPR/Cas9 editing. Microinjection, Methods in Molecular Biology. 1874, 431-457 (2019).
  44. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  45. Peel, N., Iyer, J., Naik, A., Dougherty, M. P., Decker, M., O'Connell, K. F. Protein phosphatase 1 down regulates ZYG-1 levels to limit centriole duplication. PLoS Genetics. 13 (1), 1006543 (2017).
  46. Dickinson, D. J., Pani, A. M., Heppert, J. K., Higgins, C. D., Goldstein, B. Streamlined genome engineering with a self-excising drug selection cassette. Genetics. 200 (4), 1035-1049 (2015).
  47. Norris, A. D., Kim, H. M., Colaiácovo, M. P., Calarco, J. A. Efficient genome editing in Caenorhabditis elegans with a toolkit of dual-marker selection cassettes. Genetics. 201 (2), 449-458 (2015).
  48. Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  49. Ghanta, K. S., Mello, C. C. Melting dsDNA Donor Molecules Greatly Improves Precision Genome Editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (2), (2020).
  50. Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3607-3616 (2018).

Tags

Genetik Utgåva 166 CRISPR/Cas9 C. elegans,ribonukleoproteinkomplex genomteknik rbm-3.2 genredigering mikroinjektion CRISPR-screening
CRISPR/Cas9 Redigering av <em>C. elegans rbm-3.2</em> Genen med <em>dpy-10</em> Co-CRISPR Screening Marker och monterade Ribonucleoprotein Complexes.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, A., Bergwell, M., Smith, E.,… More

Smith, A., Bergwell, M., Smith, E., Mathew, D., Iyer, J. CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.. J. Vis. Exp. (166), e62001, doi:10.3791/62001 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter