Isolatie en differentiatie van primaire witte en bruine preadipocyten van pasgeboren muizen
Summary
Dit rapport beschrijft een protocol voor de gelijktijdige isolatie van primaire bruine en witte preadipocyten van pasgeboren muizen. Geïsoleerde cellen kunnen in cultuur worden gekweekt en worden geïnduceerd om zich te onderscheiden in volgroeide witte en bruine adipocyten. De methode maakt genetische, moleculaire en functionele karakterisering van primaire vetcellen in cultuur mogelijk.
Abstract
Het begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan adipocytdifferentiatie en functie heeft veel geprofiteerd van het gebruik van vereeuwigde witte preadipocytcellijnen. Deze gekweekte cellijnen hebben echter beperkingen. Ze vangen niet volledig het diverse functionele spectrum van de heterogene adipocytpopulaties waarvan nu bekend is dat ze bestaan in witte vetdepots. Om een meer fysiologisch relevant model te bieden om de complexiteit van wit vetweefsel te bestuderen, is een protocol ontwikkeld en geoptimaliseerd om gelijktijdige isolatie van primaire witte en bruine adipocytvoorlopers van pasgeboren muizen, hun snelle uitbreiding in cultuur en hun differentiatie in vitro in volwassen, volledig functionele adipocyten mogelijk te maken. Het primaire voordeel van het isoleren van primaire cellen van pasgeborenen in plaats van volwassen muizen, is dat de vetdepots zich actief ontwikkelen en daarom een rijke bron zijn van proliferatie van preadipocyten. Primaire preadipocyten geïsoleerd met behulp van dit protocol differentiëren snel bij het bereiken van samenvloeiing en worden volledig volwassen in 4-5 dagen, een tijdelijk venster dat nauwkeurig het uiterlijk van ontwikkelde vetkussens bij pasgeboren muizen weerspiegelt. Primaire culturen die met behulp van deze strategie zijn voorbereid, kunnen met een hoge reproduceerbaarheid worden uitgebreid en bestudeerd, waardoor ze geschikt zijn voor genetische en fenotypische schermen en de studie van de cel-autonome adipocytfenotypes van genetische muismodellen mogelijk worden. Dit protocol biedt een eenvoudige, snelle en goedkope aanpak om de complexiteit van vetweefsel in vitro te bestuderen.
Introduction
Obesitas is het gevolg van een chronische onbalans tussen energie-inname en energieverbruik. Naarmate obesitas zich ontwikkelt, ondergaan witte adipocyten een enorme toename van de celgrootte die resulteert in hypoxie in het micromilieu, celdood, ontsteking en insulineresistentie1. Disfunctionele, hypertrofie adipocyten kunnen overtollige lipiden niet goed opslaan, die zich in plaats daarvan ophopen in andere weefsels waar ze insulinewerking dempen2,3. Middelen die de adipocytfunctie verbeteren en de normale lipidenpartitie tussen weefsels herstellen, worden voorspeld dat ze gunstig zijn voor de behandeling van obesitasgerelateerde aandoeningen die worden gekenmerkt door insulineresistentie zoals diabetes type 2. Fenotypische schermen in adipocyten met behulp van vereeuwigde cellijnen, zoals 3T3-L1, F442A en 10T 1/2, zijn nuttig gebleken om genetische factoren te identificeren die adipogenese reguleren en om pro-adipogenic moleculen te isoleren met antidiabetische eigenschappen4,5,6,7. Deze cellijnen weerspiegelen echter niet volledig de heterogeniteit van celtypen die aanwezig zijn in vetdepots, waaronder witte, bruine, beige en andere adipocytsubtypen met unieke kenmerken, die allemaal bijdragen aan systemische homeostase8,9,10. Verder vertonen gekweekte cellijnen vaak een verminderde reactie op externe stimuli.
Culturen van primaire adipocyten daarentegen vatten de complexiteit van in vivo adipogenese nauwkeuriger samen en primaire adipocyten vertonen robuuste functionele reacties. Primaire preadipocyten zijn meestal geïsoleerd uit de stromale vasculaire fractie van vetdepots van volwassen muizen11,12,13,14. Omdat de vetdepots van volwassen dieren echter voornamelijk bestaan uit volgroeide adipocyten met een zeer trage omloopsnelheidvan 15,16,17, levert deze aanpak een beperkte hoeveelheid preadipocyten op met een lage proliferatiesnelheid. Daarom heeft isolatie van preadipocyten van pasgeboren muizen de voorkeur om grote hoeveelheden snelgroeiende cellen te verkrijgen die in vitro kunnen worden onderscheiden. Hier is een protocol beschreven, geïnspireerd op het eerste werk met primaire bruine adipocyten van Kahn et al.18 om zowel witte als bruine preadipocyten efficiënt te isoleren die in vitro kunnen worden uitgebreid en gedifferentieerd tot volledig functionele primaire adipocyten (Figuur 1A). Het voordeel van het isoleren van primaire cellen van pasgeborenen, in tegenstelling tot volwassen muizen, is dat de vetdepots snel groeien en dus een rijke bron zijn van actief proliferatie van preadipocyten17. Cellen die met dit protocol worden geïsoleerd, hebben een hoge proliferatieve capaciteit, waardoor culturen snel kunnen worden opgeschaald. Bovendien vertonen preadipocyten van pasgeboren pups een hoger differentiatiepotentieel dan volwassen voorlopers, wat de variabiliteit in de mate van differentiatie vermindert en zo de reproduceerbaarheid verhoogt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vetweefsel is van cruciaal belang voor systemische insulinegevoeligheid en glucosehomeostase20. Obesitas-gebonden adipocyt dysfunctie is nauw geassocieerd met het begin van type 2 diabetes. Daarom kan een beter begrip van de basisbiologie en fysiologie van vetweefsel het ontwerp van nieuwe behandelingen voor metabole aandoeningen mogelijk maken. Als aanvulling op directe functionele en transcriptieanalyse van volwassen adipocyten geïsoleerd uit vetdepots21,<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn Cristina Godio van het Centro Nacional de Biotecnología in Madrid, Spanje, Mari Gantner van het Scripps Research Institute, La Jolla en Anastasia Kralli van de Johns Hopkins University in Baltimore dankbaar voor hun hulp bij het optimaliseren van dit protocol op basis van het eerste werk van Kahn et al.18. Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidies DK114785 en DK121196 aan E.S.
Materials
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- McGarry, J. D. Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).
- Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).
- Waki, H., et al. The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression. Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).
- Dominguez, E., et al. Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes. Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).
- Galmozzi, A., et al. ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue. Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).
- Ye, L., et al. TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis. Cell. 151 (1), 96-110 (2012).
- Lynes, M. D., Tseng, Y. H. Deciphering adipose tissue heterogeneity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).
- Sponton, C. H., Kajimura, S. Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1. Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).
- Gao, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
- Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes. Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122 (1), 133-143 (2005).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Kahn, C. R. Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes. Sprotocols. , (2014).
- Mills, E. L., et al. Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis. Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Pydi, S. P., et al. Adipocyte β-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis. Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).
- Sun, W., et al. snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis. Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).
- Galmozzi, A., et al. PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function. Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).
- Brown, E. L., et al. Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation. iScience. 2, 221-237 (2018).
- Shinoda, K., et al. Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes. Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E. The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo. Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).
