Выделение и дифференциация первичных белых и коричневых преадипоцитов у новорожденных мышей
Summary
В этом отчете описывается протокол одновременного выделения первичных коричневых и белых преадипоцитов у новорожденных мышей. Изолированные клетки могут быть выращены в культуре и индуцированы для дифференцировки в полностью зрелые белые и коричневые адипоциты. Метод позволяет проводить генетическую, молекулярную и функциональную характеристику первичных жировых клеток в культуре.
Abstract
Понимание механизмов, лежащих в основе дифференцировки и функции адипоцитов, значительно выиграло от использования увековеченных белых клеточных линий преадипоцитов. Однако эти культивные клеточные линии имеют ограничения. Они не полностью охватывают разнообразный функциональный спектр гетерогенных популяций адипоцитов, которые, как теперь известно, существуют в депо белого жирового полотна. Чтобы обеспечить более физиологически релевантную модель для изучения сложности белой жировой ткани, был разработан и оптимизирован протокол, позволяющий одновременно выделить первичные белые и коричневые адипоцитарные прародители от новорожденных мышей, их быстрое расширение в культуре и их дифференцировку in vitro в зрелые, полностью функциональные адипоциты. Основным преимуществом выделения первичных клеток у новорожденных, а не взрослых мышей, является то, что жировые депо активно развиваются и, следовательно, являются богатым источником пролиферирующие преадипоциты. Первичные преадипоциты, выделенные с использованием этого протокола, быстро дифференцируются по достижении слияния и становятся полностью зрелыми через 4-5 дней, временное окно, которое точно отражает появление развитых жировых подушечек у новорожденных мышей. Первичные культуры, полученные с использованием этой стратегии, могут быть расширены и изучены с высокой воспроизводимостью, что делает их пригодными для генетических и фенотипических скринингов и позволяет изучать клеточно-автономные фенотипы адипоцитов генетических моделей мышей. Этот протокол предлагает простой, быстрый и недорогой подход к изучению сложности жировой ткани in vitro.
Introduction
Ожирение является результатом хронического дисбаланса между потреблением энергии и расходом энергии. По мере развития ожирения белые адипоциты подвергаются массивному увеличению размера клеток, что приводит к гипоксии в микросреде, гибели клеток, воспалению и резистентности к инсулину1. Дисфункциональные, гипертрофированные адипоциты не могут должным образом хранить избыток липидов, которые накапливаются вместо этого в других тканях, где они ослабляют действие инсулина2,3. Агенты, которые улучшают функцию адипоцитов и восстанавливают нормальное разделение липидов между тканями, по прогнозам, будут полезны для лечения связанных с ожирением состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину, таких как диабет 2 типа. Фенотипические экраны в адипоцитах с использованием увековеченных клеточных линий, таких как 3T3-L1, F442A и 10T 1/2, оказались полезными для выявления генетических факторов, регулирующих адипогенез, и для выделения проадипогенных молекул с антидиабетическими свойствами4,5,6,7. Эти клеточные линии, однако, не полностью отражают гетерогенность типов клеток, присутствующих в адипозов, которые включают белые, коричневые, бежевые и другие подтипы адипоцитов с уникальными характеристиками, все из которых способствуют системному гомеостазу8,9,10. Кроме того, культивируемые клеточные линии часто показывают уменьшенную реакцию на внешние раздражители.
Напротив, культуры первичных адипоцитов более точно повторяют сложность адипогенеза in vivo, а первичные адипоциты демонстрируют надежные функциональные реакции. Первичные преадипоциты обычно выделяют из стромальной сосудистой фракции адипозных депо взрослых мышей11,12,13,14. Однако, поскольку жировые депо взрослых животных состоят в основном из полностью зрелых адипоцитов, которые имеют очень медленную скорость оборота15,16,17,такой подход дает ограниченное количество преадипоцитов с низкой скоростью пролиферации. Поэтому выделение преадипоцитов у новорожденных мышей предпочтительнее для получения большого количества быстро растущих клеток, которые можно дифференцировать in vitro. Здесь был описан протокол, вдохновленный первоначальной работой с первичными коричневыми адипоцитами Kahn et al.18 для эффективного выделения как белых, так и коричневых преадипоцитов, которые могут быть расширены и дифференцированы in vitro в полностью функциональные первичные адипоциты(рисунок 1A). Преимущество выделения первичных клеток у новорожденных, в отличие от взрослых мышей, заключается в том, что жировые депо быстро растут и, таким образом, являются богатым источником активно пролиферирующие преадипоциты17. Клетки, изолированные с использованием этого протокола, обладают высокой пролиферативной способностью, что позволяет быстро масштабировать культуры. Кроме того, преадипоциты новорожденных щенков демонстрируют более высокий дифференцировальный потенциал, чем взрослые прародители, что снижает вариабельность в степени дифференцировки и, таким образом, повышает воспроизводимость.
Protocol
Representative Results
Discussion
Жировая ткань имеет решающее значение для системной чувствительности к инсулину и глюкозного гомеостаза20. Дисфункция адипоцитов, связанная с ожирением, тесно связана с началом диабета 2 типа. Таким образом, более глубокое понимание базовой биологии и физиологии жировой т?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарны Кристине Годио из Национального центра биотехнологии в Мадриде, Испания, Мари Гантнер из Научно-исследовательского института Скриппса, Ла-Хойя, и Анастасии Кралли в Университете Джона Хопкинса, Балтимор, за помощь в оптимизации этого протокола на основе первоначальной работы Кана и др.18. Эта работа финансировалась грантами NIH DK114785 и DK121196 для E.S.
Materials
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- McGarry, J. D. Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).
- Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).
- Waki, H., et al. The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression. Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).
- Dominguez, E., et al. Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes. Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).
- Galmozzi, A., et al. ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue. Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).
- Ye, L., et al. TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis. Cell. 151 (1), 96-110 (2012).
- Lynes, M. D., Tseng, Y. H. Deciphering adipose tissue heterogeneity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).
- Sponton, C. H., Kajimura, S. Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1. Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).
- Gao, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
- Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes. Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122 (1), 133-143 (2005).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Kahn, C. R. Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes. Sprotocols. , (2014).
- Mills, E. L., et al. Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis. Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Pydi, S. P., et al. Adipocyte β-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis. Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).
- Sun, W., et al. snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis. Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).
- Galmozzi, A., et al. PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function. Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).
- Brown, E. L., et al. Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation. iScience. 2, 221-237 (2018).
- Shinoda, K., et al. Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes. Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E. The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo. Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).
