नवजात चूहों से प्राथमिक सफेद और भूरे रंग के प्रीडिपोसाइट्स का अलगाव और भेदभाव
Summary
इस रिपोर्ट में नवजात चूहों से प्राथमिक भूरे और सफेद preadipocytes के एक साथ अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । अलग कोशिकाओं को संस्कृति में उगाया जा सकता है और पूरी तरह से परिपक्व सफेद और भूरे रंग के एडीपोसाइट्स में अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। विधि संस्कृति में प्राथमिक वसा कोशिकाओं के आनुवंशिक, आणविक और कार्यात्मक लक्षण वर्णन को सक्षम बनाती है।
Abstract
आदिपोसाइट भेदभाव और कार्य में अंतर्निहित तंत्र की समझ अमर सफेद प्रीडिपोसाइट सेल लाइनों के उपयोग से बहुत लाभान्वित हुई है। हालांकि, इन सुसंस्कृत सेल लाइनों की सीमाएं हैं। वे विषम आदिपोसाइट आबादी के विविध कार्यात्मक स्पेक्ट्रम को पूरी तरह से कैप्चर नहीं करते हैं जो अब सफेद आदिपोस डिपो के भीतर मौजूद होने के लिए जाने जाते हैं। सफेद एडीपोज ऊतक की जटिलता का अध्ययन करने के लिए एक अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल प्रदान करने के लिए, नवजात चूहों से प्राथमिक सफेद और भूरे रंग के एडीपोसाइट जनकों के एक साथ अलगाव, संस्कृति में उनके तेजी से विस्तार और परिपक्व, पूरी तरह से कार्यात्मक आदिपोसाइट्स में उनके विट्रो में उनके भेदभाव को सक्षम करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित और अनुकूलित किया गया है। वयस्क चूहों के बजाय नवजात शिशु से प्राथमिक कोशिकाओं को अलग करने का प्राथमिक लाभ यह है कि एडिपोज डिपो सक्रिय रूप से विकसित हो रहे हैं और इसलिए, preadipocytes प्रसार का एक समृद्ध स्रोत हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग किए गए प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स संगम तक पहुंचने पर तेजी से अंतर करते हैं और 4-5 दिनों में पूरी तरह से परिपक्व हो जाते हैं, एक अस्थायी खिड़की जो नवजात चूहों में विकसित वसा पैड की उपस्थिति को सही रूप से दर्शाती है। इस रणनीति का उपयोग करके तैयार प्राथमिक संस्कृतियों का विस्तार किया जा सकता है और उच्च प्रजनन क्षमता के साथ अध्ययन किया जा सकता है, जिससे उन्हें आनुवंशिक और फेनोटाइपिक स्क्रीन के लिए उपयुक्त बनाया जा सकता है और आनुवंशिक माउस मॉडल के सेल-स्वायत्त एडीपोसाइट फेनोटाइप के अध्ययन को सक्षम किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल विट्रो में एडीपोज ऊतक की जटिलता का अध्ययन करने के लिए एक सरल, तेजी से और सस्ता दृष्टिकोण प्रदान करता है।
Introduction
मोटापा ऊर्जा के सेवन और ऊर्जा व्यय के बीच एक पुरानी असंतुलन से परिणाम है । जैसे-जैसे मोटापा विकसित होता है, सफेद एडीपोसाइट्स कोशिका के आकार में बड़े पैमाने पर विस्तार से गुजरते हैं जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोएनवायरमेंट, सेल डेथ, सूजन और इंसुलिन प्रतिरोध 1 में हाइपोक्सियाहोताहै। बेकार, हाइपरट्रोफिड एडिपोसाइट्स अतिरिक्त लिपिड को ठीक से स्टोर नहीं कर सकते हैं, जो इसके बजाय अन्य ऊतकों में जमा होते हैं जहां वे इंसुलिन कार्रवाई2,3को गीला करते हैं। एजेंट जो एडिपोसिट फ़ंक्शन में सुधार करते हैं और ऊतकों के बीच सामान्य लिपिड विभाजन को बहाल करते हैं, मोटापे से जुड़ी स्थितियों के उपचार के लिए फायदेमंद होने की भविष्यवाणी की जाती है जैसे कि टाइप 2 मधुमेह। अमर कोशिका रेखाओं का उपयोग करके एडिपोसाइट्स में फेनोटाइपिक स्क्रीन, जैसे 3T3-L1, F442A, और 10T 1/2, आनुवंशिक कारकों की पहचान करने के लिए उपयोगी साबित हुई है जो एडिपोजेनेसिस को विनियमित करते हैं और मधुमेह रोधी गुणों के साथ प्रो-एडिपोजेनिक अणुओं को अलग करने के लिए4,5,6,7। हालांकि, ये सेल लाइनें आदिपोज डिपो में मौजूद सेल प्रकारों की विषमता को पूरी तरह से प्रतिबिंबित नहीं करती हैं, जिसमें सफेद, भूरे, बेज और अद्वितीय विशेषताओं के साथ अन्य एडिपोसिट उपप्रकार शामिल हैं, जिनमें से सभी प्रणालीगत होमोस्टेसिस8,9,10में योगदान देते हैं। इसके अलावा, सुसंस्कृत सेल लाइनें अक्सर बाहरी उत्तेजनाओं के प्रति कम प्रतिक्रिया दिखाती हैं।
इसके विपरीत, प्राथमिक एडिपोसाइट्स की संस्कृतियां वीवो एडिपोजेनेसिस में जटिलता को अधिक सटीकता से पुनः कृत करती हैं, और प्राथमिक एडीपोसाइट्स मजबूत कार्यात्मक प्रतिक्रियाएं दिखाते हैं। प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स आमतौर पर वयस्क चूहों के आदिपोज डिपो के स्ट्रोमल संवहनी अंश से अलग होते हैं11,12,13,14. हालांकि, वयस्क जानवरों के एडिपोस डिपो में मुख्य रूप से पूरी तरह से परिपक्व एडिपोसाइट्स होते हैं जिनमें बहुत धीमी गति से कारोबार की दर15,16,17होती है, इस दृष्टिकोण से कम प्रसार दर के साथ सीमित मात्रा में प्रीडिपोसाइट्स होते हैं। इसलिए, नवजात चूहों से प्रीडिपोसाइट्स का अलगाव तेजी से बढ़ती कोशिकाओं की बड़ी मात्रा प्राप्त करने के लिए बेहतर है जिसे विट्रो में विभेदित किया जा सकता है। यहां, एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जो क्हान एट अल के प्राथमिक भूरे रंग के एडीपोसाइट्स के साथ प्रारंभिक कार्य से प्रेरित है।18 सफेद और भूरे रंग के प्रीडिपोसाइट्स दोनों को कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए जिसे पूरी तरह से कार्यात्मक प्राथमिक एडीपोसाइट्स(चित्रा 1 ए)में विस्तारित और विभेदित किया जा सकता है। वयस्क चूहों के विपरीत नवजात शिशु से प्राथमिक कोशिकाओं को अलग करने का लाभ यह है कि एडिपोज डिपो तेजी से बढ़ रहे हैं और इस प्रकार सक्रिय रूप से पूर्वाधिकारियों17का प्रसार करने का एक समृद्ध स्रोत हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग कोशिकाओं में उच्च प्रसार क्षमता होती है, जो संस्कृतियों के तेजी से पैमाने पर सक्षम होती है। इसके अलावा, नवजात पिल्ले से प्रीडिपोसाइट्स वयस्क जनकों की तुलना में उच्च भेदभाव क्षमता प्रदर्शित करते हैं, जो भेदभाव की सीमा में अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता को कम करता है और इस प्रकार प्रजनन क्षमता को बढ़ाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रणालीगत इंसुलिन संवेदनशीलता और ग्लूकोज हो्योस्टेसिस20के लिए एडीपोज ऊतक महत्वपूर्ण है । मोटापा से जुड़े एडिपोसाइट डिसफंक्शन टाइप 2 डायबिटीज की शुरुआत से कसकर जुड़ा हुआ है । इसलिए, एडीपोज ऊत…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक मैड्रिड, स्पेन में सेंट्रो नैसिनल डी बायोटेक्नोलोगिया में क्रिस्टीना गोडियो, स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट, ला जोला में मारी गैंटर और जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय, बाल्टीमोर में अनास्तासिया क्राली के आभारी हैं, जो क्हान एट अल अल18के प्रारंभिक कार्य के आधार पर इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने में सहायता के लिए हैं । इस काम के लिए NIH अनुदान DK1114785 और DK121196 द्वारा वित्त पोषित किया गया था ईएस
Materials
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
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