Isolasjon og differensiering av primærhvite og brune preadipocytter fra nyfødte mus
Summary
Denne rapporten beskriver en protokoll for samtidig isolering av primære brune og hvite preadipocytter fra nyfødte mus. Isolerte celler kan dyrkes i kultur og induseres for å skille seg ut i fullt modne hvite og brune adipocytter. Metoden muliggjør genetisk, molekylær og funksjonell karakterisering av primære fettceller i kulturen.
Abstract
Forståelsen av mekanismene som ligger til grunn for adipocyttdifferensiering og funksjon har hatt stor nytte av bruk av udødelige hvite preadipocyttcellelinjer. Disse kultiverte cellelinjene har imidlertid begrensninger. De fanger ikke fullt ut det mangfoldige funksjonelle spekteret av de heterogene adipocyttpo-populasjonene som nå er kjent for å eksistere innenfor hvite fettdepoter. For å gi en mer fysiologisk relevant modell for å studere kompleksiteten til hvitt fettvev, har en protokoll blitt utviklet og optimalisert for å muliggjøre samtidig isolasjon av primære hvite og brune adipocyttforfedre fra nyfødte mus, deres raske ekspansjon i kulturen og deres differensiering in vitro til modne, fullt funksjonelle adipocytter. Den primære fordelen med å isolere primærceller fra nyfødte, i stedet for voksne mus, er at fettdepotene utvikler seg aktivt og derfor er en rik kilde til spredning av preadipocytter. Primære preadipocytter isolert ved hjelp av denne protokollen skiller seg raskt ved å nå samløp og blir fullt modne på 4-5 dager, et temporalt vindu som nøyaktig gjenspeiler utseendet på utviklede fettputer hos nyfødte mus. Primærkulturer utarbeidet ved hjelp av denne strategien kan utvides og studeres med høy reproduserbarhet, noe som gjør dem egnet for genetiske og fenotypiske skjermer og muliggjør studiet av de celle-autonome adipocyttfenotypene av genetiske musemodeller. Denne protokollen tilbyr en enkel, rask og billig tilnærming for å studere kompleksiteten til fettvev in vitro.
Introduction
Fedme skyldes en kronisk ubalanse mellom energiinntak og energiforbruk. Etter hvert som fedme utvikler seg, gjennomgår hvite adipocytter en massiv utvidelse i cellestørrelse som resulterer i hypoksi i mikromiljøet, celledød, betennelse og insulinresistens1. Dysfunksjonelle, hypertrofierte adipocytter kan ikke lagre overflødige lipider på riktig måte, som akkumuleres i stedet i andre vev der de demper insulinvirkning2,3. Midler som forbedrer adipocyttfunksjonen og gjenoppretter normal lipidpartisjonering blant vev, forventes å være gunstige for behandling av fedmerelaterte tilstander preget av insulinresistens som type 2 diabetes. Fenotypiske skjermer i adipocytter ved hjelp av udødelige cellelinjer, for eksempel 3T3-L1, F442A og 10T 1/2, har vist seg nyttige for å identifisere genetiske faktorer som regulerer adipogenese og isolere pro-adipogene molekyler med antidiabetiske egenskaper4,5,6,7. Disse cellelinjene gjenspeiler imidlertid ikke fullt ut heterogeniteten til celletyper som finnes i fettdepoter, som inkluderer hvite, brune, beige og andre adipocyttundertyper med unike egenskaper, som alle bidrar til systemisk homeostase8,9,10. Videre viser kultiverte cellelinjer ofte en redusert respons på ytre stimuli.
I motsetning til dette rekapitulerer kulturer av primære adipocytter mer nøyaktig kompleksiteten til in vivo-adipogenese, og primære adipocytter viser robuste funksjonelle responser. Primære preadipocytter er vanligvis isolert fra den stromale vaskulære brøkdelen av fettdepoter av voksne mus11,12,13,14. Men fordi fettdepotene til voksne dyr hovedsakelig består av fullt modne adipocytter som har en veldig langsomomsetningshastighet 15,16,17, gir denne tilnærmingen en begrenset mengde preadipocytter med lav spredningshastighet. Derfor er isolasjon av preadipocytter fra nyfødte mus å foretrekke å oppnå store mengder raskt voksende celler som kan differensieres in vitro. Her er det beskrevet en protokoll, inspirert av det første arbeidet med primærbrune adipocytter av Kahn et al.18 for effektivt å isolere både hvite og brune preadipocytter som kan utvides og differensieres in vitro til fullt funksjonelle primære adipocytter (Figur 1A). Fordelen med å isolere primære celler fra nyfødte, i motsetning til voksne mus, er at fettdepotene vokser raskt og dermed er en rik kilde til aktivt spredning av preadipocytter17. Celler isolert ved hjelp av denne protokollen har høy proliferativ kapasitet, noe som muliggjør rask oppskalering av kulturer. I tillegg viser preadipocytter fra nyfødte valper høyere differensieringspotensial enn voksne forfedre, noe som reduserer trivsel i graden av differensiering og dermed øker reproduserbarheten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fettvev er avgjørende for systemisk insulinfølsomhet og glukose homeostase20. Fedme-bundet adipocyt dysfunksjon er tett forbundet med utbruddet av type 2 diabetes. Derfor kan større forståelse av grunnleggende biologi og fysiologi av fettvev muliggjøre design av nye behandlinger for metabolske forstyrrelser. Som et supplement til direkte funksjonell og transkripsjonell analyse av modne adipocytter isolert fra fettdepoter21,22, har kul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er takknemlige til Cristina Godio ved Centro Nacional de Biotecnología i Madrid, Spania, Mari Gantner ved Scripps Research Institute, La Jolla og Anastasia Kralli ved Johns Hopkins University, Baltimore, for hjelp til å optimalisere denne protokollen basert på det første arbeidet til Kahn et al.18. Dette arbeidet ble finansiert av NIH-tilskudd DK114785 og DK121196 til E.S.
Materials
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- McGarry, J. D. Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).
- Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).
- Waki, H., et al. The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression. Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).
- Dominguez, E., et al. Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes. Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).
- Galmozzi, A., et al. ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue. Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).
- Ye, L., et al. TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis. Cell. 151 (1), 96-110 (2012).
- Lynes, M. D., Tseng, Y. H. Deciphering adipose tissue heterogeneity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).
- Sponton, C. H., Kajimura, S. Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1. Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).
- Gao, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
- Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes. Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122 (1), 133-143 (2005).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Kahn, C. R. Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes. Sprotocols. , (2014).
- Mills, E. L., et al. Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis. Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Pydi, S. P., et al. Adipocyte β-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis. Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).
- Sun, W., et al. snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis. Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).
- Galmozzi, A., et al. PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function. Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).
- Brown, E. L., et al. Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation. iScience. 2, 221-237 (2018).
- Shinoda, K., et al. Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes. Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E. The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo. Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).
