Isolering och differentiering av primära vita och bruna preadipocyter från nyfödda möss
Summary
Denna rapport beskriver ett protokoll för samtidig isolering av primära bruna och vita preadipocytes från nyfödda möss. Isolerade celler kan odlas i kultur och induceras för att skilja sig åt i fullt mogna vita och bruna adipocyter. Metoden möjliggör genetisk, molekylär och funktionell karakterisering av primära fettceller i kulturen.
Abstract
Förståelsen av mekanismerna bakom adipocyte differentiering och funktion har i hög grad gynnats av användningen av odödliga vita preadipocyte cellinjer. Dessa odlade cellinjer har dock begränsningar. De fångar inte helt det olika funktionella spektrumet av de heterogena adipocytpopulationerna som nu är kända för att existera inom vita fettdepåer. För att ge en mer fysiologiskt relevant modell för att studera komplexiteten hos vit fettvävnad har ett protokoll utvecklats och optimerats för att möjliggöra samtidig isolering av primära vita och bruna adipocyt-stamceller från nyfödda möss, deras snabba expansion i kulturen och deras differentiering in vitro till mogna, fullt funktionella adipocyter. Den främsta fördelen med att isolera primära celler från nyfödda, snarare än vuxna möss, är att fettdepåerna aktivt utvecklas och därför är en rik källa till prolifererande preadipocyter. Primära preadipocytes isolerade med detta protokoll skiljer sig snabbt när du når sammanflöde och blir helt mogen i 4-5 dagar, ett tidsmässigt fönster som exakt återspeglar utseendet på utvecklade fettkuddar hos nyfödda möss. Primära kulturer som utarbetas med hjälp av denna strategi kan utökas och studeras med hög reproducerbarhet, vilket gör dem lämpliga för genetiska och fenotypiska skärmar och möjliggör studier av cellautonoma adipocyte fenotyper av genetiska musmodeller. Detta protokoll erbjuder ett enkelt, snabbt och billigt tillvägagångssätt för att studera komplexiteten hos fettvävnad in vitro.
Introduction
Fetma är ett resultat av en kronisk obalans mellan energiintag och energiförbrukning. När fetma utvecklas genomgår vita adipocyter en massiv expansion i cellstorlek som resulterar i hypoxi i mikromiljön, celldöd, inflammation och insulinresistens1. Dysfunktionella, hypertrofierade adipocyter kan inte korrekt lagra överflödiga lipider, som ackumuleras istället i andra vävnader där de dämparinsulinåtgärden 2,3. Medel som förbättrar adipocyte funktion och återställa normala lipid partitionering bland vävnader förutspås vara fördelaktigt för behandling av fetma-associerade villkor som kännetecknas av insulinresistens såsom typ 2 diabetes. Fenotypiska skärmar i adipocyter med hjälp av odödliga cellinjer, såsom 3T3-L1, F442A och 10T 1/2, har visat sig vara användbara för att identifiera genetiska faktorer som reglerar adipogenes och för att isolera pro-adipogenic molekyler med anti-diabetiker egenskaper4,5,6,7. Dessa cellinjer återspeglar dock inte helt heterogeniteten hos celltyper som finns i fettdepåer, vilket inkluderar vita, bruna, beige och andra adipocytundertyper med unika egenskaper, som alla bidrar till systemisk homeostas8,9,10. Vidare visar odlade cellinjer ofta ett minskat svar på yttre stimuli.
Däremot rekapitulerar kulturer av primära adipocyter mer exakt komplexiteten i in vivo adipogenesis, och primära adipocyter visar robusta funktionella svar. Primära preadipocyter isoleras vanligtvis från den stromala vaskulär fraktionen av fettdepåer av vuxna möss11,12,13,14. Men eftersom fettdepåerna hos vuxna djur huvudsakligen består av fullt mogna adipocyter som har en mycket långsamomsättningshastighet 15,16,17, ger detta tillvägagångssätt en begränsad mängd preadipocyter med låg spridningshastighet. Därför är isolering av preadipocyter från nyfödda möss att föredra för att få stora mängder snabbt växande celler som kan differentieras in vitro. Här har ett protokoll beskrivits, inspirerat av det inledande arbetet med primära bruna adipocyter av Kahn et al.18 för att effektivt isolera både vita och bruna preadipocyter som kan utvidgas och differentieras in vitro till fullt fungerande primära adipocyter (Figur 1A). Fördelen med att isolera primära celler från nyfödda, i motsats till vuxna möss, är att fettdepåerna växer snabbt och därmed är en rik källa till aktivt prolifererande preadipocyter17. Celler som isoleras med detta protokoll har hög proliferativ kapacitet, vilket möjliggör snabb uppskalning av kulturer. Dessutom uppvisar preadipocyter från nyfödda valpar högre differentieringspotential än vuxna stamceller, vilket minskar välbefinnandet i differentieringsens omfattning och därmed ökar reproducerbarheten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fettvävnad är avgörande för systemisk insulinkänslighet och glukoshomeostas20. Fetma-kopplade adipocyte dysfunktion är tätt associerad med uppkomsten av typ 2 diabetes. Därför kan större förståelse för fettvävnadens grundläggande biologi och fysiologi möjliggöra utformningen av nya behandlingar för metabola störningar. Som ett komplement till direkt funktionell och transkriptionell analys av mogna adipocyter isolerade frånfettdepåer 21,<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är tacksamma mot Cristina Godio vid Centro Nacional de Biotecnología i Madrid, Spanien, Mari Gantner vid The Scripps Research Institute, La Jolla, och Anastasia Kralli vid Johns Hopkins University, Baltimore, för hjälp med att optimera detta protokoll baserat på kahn et al.18. Detta arbete finansierades av NIH-bidrag DK114785 och DK121196 till E.S.
Materials
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- McGarry, J. D. Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).
- Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).
- Waki, H., et al. The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression. Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).
- Dominguez, E., et al. Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes. Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).
- Galmozzi, A., et al. ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue. Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).
- Ye, L., et al. TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis. Cell. 151 (1), 96-110 (2012).
- Lynes, M. D., Tseng, Y. H. Deciphering adipose tissue heterogeneity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).
- Sponton, C. H., Kajimura, S. Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1. Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).
- Gao, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
- Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes. Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122 (1), 133-143 (2005).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Kahn, C. R. Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes. Sprotocols. , (2014).
- Mills, E. L., et al. Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis. Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Pydi, S. P., et al. Adipocyte β-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis. Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).
- Sun, W., et al. snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis. Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).
- Galmozzi, A., et al. PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function. Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).
- Brown, E. L., et al. Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation. iScience. 2, 221-237 (2018).
- Shinoda, K., et al. Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes. Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E. The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo. Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).
