Isolierung und Differenzierung primärer weißer und brauner Präadipozyten von neugeborenen Mäusen
Summary
Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur gleichzeitigen Isolierung von primären braunen und weißen Präadipozyten von neugeborenen Mäusen. Isolierte Zellen können in Kultur gezüchtet und dazu gebracht werden, sich in voll ausgereifte weiße und braune Adipozyten zu differenzieren. Die Methode ermöglicht die genetische, molekulare und funktionelle Charakterisierung primärer Fettzellen in Kultur.
Abstract
Das Verständnis der Mechanismen, die der Differenzierung und Funktion von Adipozyten zugrunde liegen, hat durch die Verwendung immortalisierter weißer Präadipozytenzelllinien stark profitiert. Diese kultivierten Zelllinien haben jedoch Einschränkungen. Sie erfassen nicht vollständig das vielfältige funktionelle Spektrum der heterogenen Adipozytenpopulationen, von denen heute bekannt ist, dass sie in weißen Fettdepots existieren. Um ein physiologisch relevanteres Modell zur Untersuchung der Komplexität von weißem Fettgewebe bereitzustellen, wurde ein Protokoll entwickelt und optimiert, um die gleichzeitige Isolierung primärer weißer und brauner Adipozytenvorläufer von neugeborenen Mäusen, ihre schnelle Expansion in Kultur und ihre Differenzierung in vitro in reife, voll funktionsfähige Adipozyten zu ermöglichen. Der Hauptvorteil der Isolierung von Primärzellen von Neugeborenen und nicht von erwachsenen Mäusen besteht darin, dass sich die Fettdepots aktiv entwickeln und daher eine reiche Quelle für proliferierende Präadipozyten sind. Primäre Präadipozyten, die mit diesem Protokoll isoliert wurden, differenzieren sich schnell nach Erreichen der Konfluenz und werden in 4-5 Tagen vollständig ausgereift, ein zeitliches Fenster, das das Auftreten von entwickelten Fettpolstern bei neugeborenen Mäusen genau widerspiegelt. Primärkulturen, die mit dieser Strategie hergestellt wurden, können mit hoher Reproduzierbarkeit erweitert und untersucht werden, wodurch sie für genetische und phänotypische Screens geeignet sind und die Untersuchung der zellautonomen Adipozytenphänotypen genetischer Mausmodelle ermöglichen. Dieses Protokoll bietet einen einfachen, schnellen und kostengünstigen Ansatz, um die Komplexität von Fettgewebe in vitro zu untersuchen.
Introduction
Fettleibigkeit resultiert aus einem chronischen Ungleichgewicht zwischen Energieaufnahme und Energieverbrauch. Wenn sich Fettleibigkeit entwickelt, durchlaufen weiße Adipozyten eine massive Expansion der Zellgröße, die zu Hypoxie in der Mikroumgebung, Zelltod, Entzündung und Insulinresistenzführt 1. Dysfunktionale, hypertrophierte Adipozyten können überschüssige Lipide nicht richtig speichern, die sich stattdessen in anderen Geweben ansammeln, wo sie die Insulinwirkung2,3dämpfen. Es wird vorhergesagt, dass Mittel, die die Funktion der Adipozyten verbessern und die normale Lipidaufteilung zwischen den Geweben wiederherstellen, für die Behandlung von Adipositas-assoziierten Erkrankungen, die durch Insulinresistenz gekennzeichnet sind, wie Typ-2-Diabetes, von Vorteil sind. Phänotypische Screens in Adipozyten mit immortalisierten Zelllinien wie 3T3-L1, F442A und 10T 1/2 haben sich als nützlich erwiesen, um genetische Faktoren zu identifizieren, die die Adipogenese regulieren, und um pro-adipogene Moleküle mit antidiabetischen Eigenschaften zu isolieren4,5,6,7. Diese Zelllinien spiegeln jedoch nicht vollständig die Heterogenität der Zelltypen wider, die in Fettdepots vorhanden sind, zu denen weiße, braune, beige und andere Adipozytensubtypen mit einzigartigen Eigenschaften gehören, die alle zur systemischen Homöostase beitragen8,9,10. Darüber hinaus zeigen kultivierte Zelllinien oft eine verminderte Reaktion auf äußere Reize.
Im Gegensatz dazu rekapitulieren Kulturen primärer Adipozyten die Komplexität der In-vivo-Adipogenese genauer, und primäre Adipozyten zeigen robuste funktionelle Reaktionen. Primäre Präadipozyten werden typischerweise aus der stromalen vaskulären Fraktion der Fettdepots erwachsener Mäuse isoliert11,12,13,14. Da die Fettdepots erwachsener Tiere jedoch hauptsächlich aus voll ausgereiften Adipozyten bestehen, die eine sehr langsame Fluktuationsrate15,16,17aufweisen, ergibt dieser Ansatz eine begrenzte Menge an Präadipozyten mit einer niedrigen Proliferationsrate. Daher ist die Isolierung von Präadipozyten von neugeborenen Mäusen vorzuziehen, um große Mengen schnell wachsender Zellen zu erhalten, die in vitro differenziert werden können. Hier wurde ein Protokoll beschrieben, inspiriert von den ersten Arbeiten mit primären braunen Adipozyten von Kahn et al.18, um sowohl weiße als auch braune Präadipozyten effizient zu isolieren, die in vitro zu voll funktionsfähigen primären Adipozyten expandiert und differenziert werden können (Abbildung 1A). Der Vorteil der Isolierung von Primärzellen von Neugeborenen im Gegensatz zu erwachsenen Mäusen besteht darin, dass die Fettdepots schnell wachsen und somit eine reiche Quelle für aktiv proliferierende Präadipozyten sind17. Zellen, die mit diesem Protokoll isoliert wurden, haben eine hohe Proliferativkapazität, was ein schnelles Scale-up von Kulturen ermöglicht. Darüber hinaus weisen Präadipozyten von neugeborenen Welpen ein höheres Differenzierungspotenzial auf als erwachsene Vorläufer, was die Well-to-Well-Variabilität im Differenzierungsumfang reduziert und damit die Reproduzierbarkeit erhöht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fettgewebe ist entscheidend für die systemische Insulinsensitivität und Glukoseöostase20. Adipositas-assoziierte Adipozyten-Dysfunktion ist eng mit dem Auftreten von Typ-2-Diabetes verbunden. Daher kann ein besseres Verständnis der grundlegenden Biologie und Physiologie des Fettgewebes die Entwicklung neuer Behandlungen für Stoffwechselstörungen ermöglichen. Als Ergänzung zur direkten funktionellen und transkriptionellen Analyse reifer Adipozyten, die aus Fettdepots21</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Cristina Godio vom Centro Nacional de Biotecnología in Madrid, Spanien, Mari Gantner vom Scripps Research Institute, La Jolla, und Anastasia Kralli von der Johns Hopkins University, Baltimore, für die Unterstützung bei der Optimierung dieses Protokolls basierend auf den ersten Arbeiten von Kahn et al.18. Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse DK114785 und DK121196 an E.S.
Materials
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
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