Birbirine Bağlı Nöronların Mikron Ölçekli Organizasyonu için Manyetik Platformların İmalatı
Summary
Bu çalışma, nöronal organizasyonun kontrolü için yerel manyetik kuvvetlerin mühendisliğine aşağıdan yukarıya bir yaklaşım sunun. Manyetik nanopartiküllerle (MNP) yüklenen nöron benzeri hücreler, dik manyetizasyonlu mikro desenli bir platform tarafından kaplanır ve kontrol edilir. Ayrıca manyetik karakterizasyon, MNP hücresel alım, hücre canlılığı ve istatistiksel analiz açıklanmaktadır.
Abstract
Nöronları organize sinir ağlarına yönlendirme yeteneğinin rejeneratif tıp, doku mühendisliği ve biyo-interfacing için büyük etkileri vardır. Birçok çalışma, nöronları kimyasal ve topoğrafik ipuçları kullanarak yönlendirmeyi amaçladı. Bununla birlikte, geniş alanlar üzerinde mikron ölçeğinde örgütsel kontrol raporları azdır. Burada, nöronların önceden ayarlanmış bölgelere yerleştirilmesi ve mikro desenli, manyetik elementlerle gömülü manyetik platformlar kullanılarak mikron ölçeğinde çözünürlükle nöronal büyümenin yönlendirilmesinde etkili bir yöntem tanımlanmıştır. Nöronların manyetik nanopartiküllerle (MNPs) yüklenmesinin onları manyetik gradyanlardan etkilenebilecek hassas manyetik birimlere dönüştürdüğü gösterilmiştir. Bu yaklaşımın ardından, yaygın bir nöron benzeri model olan PC12 hücrelerinin kaplandığı ve süperparmagnetik nanopartiküllerle yüklendiği benzersiz bir manyetik platform üretilmiştir. Manyetik desenlere doğru etkili çekim kuvvetleri sağlamak için stabil dik manyetizasyona sahip ferromanyetik (FM) çok katmanlı ince filmler birikti. Manyetik platformların üzerine kaplanmış ve farklılaştırılmış bu MNP yüklü PC12 hücreleri tercihen manyetik desenlere tutturuldu ve neurit büyüme desen şekliyle iyi hizalandı ve yönlendirilmiş ağlar oluşturdu. Manyetik özelliklerin nicel karakterizasyon yöntemleri, hücresel MNP alımı, hücre canlılığı ve sonuçların istatistiksel analizi sunulmaktadır. Bu yaklaşım, sinir ağı oluşumunun kontrolünü sağlar ve ağların in vitro çalışmaları için etkili bir araç olabilen ve yeni terapötik biyointerör yönleri sunabilen manyetik kuvvetlerin manipülasyonu yoluyla nöron-elektrot arayüzünü geliştirir.
Introduction
Nöronların mikropatternasyonu doku yenilenmesi için büyük bir potansiyele sahiptir1,2,3,4,5 ve nöro-elektronik cihazların geliştirilmesi6,7,8. Bununla birlikte, nöronların biyolojik dokularda olduğu gibi yüksek uzamsal çözünürlükte mikron ölçekli konumlandırılması önemli bir zorluk teşkil eder. Bu ölçekte önceden tasarlanmış yapıların oluşturulması, soma hareketliliğini ve aksonal büyümeyi lokal olarak kontrol ederek sinir hücresi süreçlerinin yönlendirilmesini gerektirir. Önceki çalışmalar, nöronal büyümeyi yönlendirmek için kimyasal ve fiziksel ipuçları9,10,11,12’nin kullanılmasını önermiştir. Burada, yeni bir yaklaşım,13 , 14 , 15,16,17manyetik alangradyanlarıtarafından hücre konumlandırmasını kontrol etmeye odaklanır, MNP’lerle yüklü hücreleri uzaktan manipüle edilebilen manyetik duyarlı birimlere dönüştürür.
Manyetik çip ve MNP yüklü hücreler kullanarak hücresel yanıtları teşvik etmek için gereken kuvveti karakterize eden Kunze ve ark., erken aksonal uzamanın hücrelerin içindeki mekanik gerilim tarafından tetiklenebileceğini kanıtladı18. Tay ve ark. gelişmiş manyetik alan gradyanları ile mikro fabrikasyon substratların, kalsiyum gösterge boyaları19kullanılarak MNP’lerle yapılan sinir devrelerinin kablosuz uyarılmasına izin verdiğini doğruladı. Dahası, Tseng ve ark. hücrelerin içindeki nanopartikülleri birleştirdi, bu da hücresel gerilime yaklaşan lokalize nanopartikül aracılı kuvvetlerle sonuçlandı20. Bu, mekanik kuvvetlere hücresel tepkinin incelenmesine yardımcı olan tanımlanmış mikromanyetik substrat desenlerinin imalat edilmesine yol açtı. Lokalize nanopartikül aracılı kuvvetlerin uygulanmasından kaynaklanan hücresel gerilim, nanopartiküllerin hücreler içinde birleştirilmesiyle elde edilmiştir20. Manyetik boncuklarla etiketlenmiş tek tek hücrelerin hareketini kontrol etmek için CMOS çipine bir dizi mikro elektromıknatıs gömen Lee ve ark. tarafından tamamlayıcı bir metal oksit yarı iletken (CMOS)-mikroakışkan hibrid sistem geliştirilmiştir21.
Alon ve ark. hücreleri bulmak için manyetik “sıcak noktalar” olarak mikro ölçekli, önceden programlanmış, manyetik pedler kullandı22. Belirli hücre altı konumlarda nanopartikülleri lokalize etmek için mikro desenli manyetik diziler kullanılarak hücrelerde belirli aktivite uyarılabilir23. Hücresel MNP alımı sülük, sıçan ve fare birincil nöronlarında başarıyla gösterilmiştir24,25,26. Burada, bu daha önce MNPs27’ninyüksek alımını gösterdiği bildirilen bir sıçan PC12 feokromositoma hücre hattında gösterilmiştir. Son yıllarda, kanser tedavilerinde ilaç dağıtımı ve termoterapi de dahil olmak üzere MNP’lerin çeşitli tıbbi uygulamaları olmuştur28,29,30,31. Özellikle, çalışmalar MNP’lerin ve nöron ağlarının uygulanmasıyla ilgilenir32,33,34,35. Bununla birlikte, MNP’leri tek hücreli düzeyde kullanan nöronların manyetik organizasyonu daha fazla araştırmayı hak ediyor.
Bu çalışmada, nöronal düzenlemeyi kontrol etmek için önceden tasarlanmış platformlar aracılığıyla yerel manyetik kuvvetleri tasarlamak için aşağıdan yukarıya bir yaklaşım tanımlanmıştır. FM çok katmanlı mikron ölçekli desenlerin imalatı sunulmuştur. Bu benzersiz, FM çok katmanlı yapı, tüm manyetik desenlere doğru etkili çekim kuvvetleri sağlayan kararlı dik manyetizasyon oluşturur. İnkübasyon yoluyla, MNP’ler PC12 hücrelerine yüklenerek manyetik hassas birimlere dönüştürüldü. Manyetik platformların üzerinde kaplanmış ve farklılaştırılmış MNP yüklü hücreler tercihen manyetik desenlere tutturuldu ve neurit büyüme desen şekliyle iyi hizalandı ve yönlendirilmiş ağlar oluşturdu. FM çok katmanlı ve MNP’lerin manyetik özelliklerini karakterize etmek için çeşitli yöntemler tanımlanmıştır ve hücresel MNP alımı ve hücre canlılığı tahlilleri için teknikler de sunulmuştur. Ayrıca nöronal büyümenin morfometrik parametreleri ve sonuçların istatistiksel analizi ayrıntılı olarak yer sunulur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Temsili sonuçlar, mikron ölçeğinde nöronal ağ oluşumunu kontrol etmek ve düzenlemek için sunulan metodolojinin etkinliğini göstermektedir. MNP yüklü PC12 hücreleri canlı kaldı ve FM elektrotlardan belirli bölgelere manyetik kuvvetler tarafından çekilen manyetik hassas birimlere dönüştürüldü. Bu en iyi şekilde gösterilmiştir Şekil 5CHücrelerin tercihen ince çizgilere değil, altıgenlerin daha büyük köşelerine yapıştığı yer. Ayrıca, hücrelerin dallanm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, İsrail ve İsrail Bilim Vakfı (569/16) tarafından desteklendi.
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 15710 | |
| 6-well cell culture plate | FALCON | 353846 | |
| 96-well cell culture plate | SPL life sciences | 30096 | |
| Amphotericin B solution | Biological Industries | 03-028-1B | |
| AZ 1514H photoresist | MicroChemicals GmbH | ||
| AZ 351 B developer | MicroChemicals GmbH | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Biological Industries | 03-010-1B | |
| Cell and Tissue cultur flask | Biofil | TCF002250 | 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One | 627-160 | 35 mm |
| Cell Proliferation Kit (XTT-based) | Biological Industries | 20-300-1000 | |
| Centrifuge tube | Biofil | CFT021500 | 50 mL |
| Co80Fe20 at% sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
| Collagen type I | Corning Inc. | 354236 | Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-165-152 | |
| DAPI fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Disposable needle | KDL | 23 G | |
| Disposable syringe | Medispo | 1160227640 | 10 mL |
| Donor horse serum | Biological Industries | 04-124-1A | |
| ELISA reader | Merk Millipore | BioTek synergy 4 hybrid microplate reader | |
| Ethanol 70% | ROMICAL LTD | 19-009102-80 | |
| Ethanol absolute (Dehydrated) | Biolab-chemicals | 52505 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| Fresh murine β-NGF | Peprotech | 450-34 | |
| GMW C-frame electromagnet . | Buckley systems LTD | 3470, 45 mm | |
| Hydrochloric acid 32% | DAEJUNG CHEMICAL & METALS | 4170-4100 | |
| ImageJ | US National Institutes of Health, Bethesda | NeuronJ plugin | |
| Inductively coupled plasma (ICP) | Ametek Spectro | SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma | |
| Keithley source-measure | Keithley | 2400 | |
| Keithley switching system | Keithley | 3700 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Light microscope | Leica | DMIL LED | |
| Maskless photolithography | Heidelberg Inst. | MLA150 | |
| Microscope Slides | BAR-NAOR | BN1042000C | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 438073 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Sigma | D9663 | |
| PBS 10x | hylabs | BP507/1LD | |
| PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
| Pd sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
| Penicillin-streptomycin nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| PrestoBlue cell viability reagent | Molecular probes | A-13261 | resazurin-based |
| Rabbit antibody to α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | ||
| RF magnetron sputtering system | Orion AJA Int. | Orion 8 | |
| RPMI 1640 with l-glutamine | Biological Industries | 01-100-1A | |
| Sonication bath | KUDOS | SK3210HP | Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W |
| SQUID magnetometer | Quantum Design, CA | ||
| Triton X-100 | CHEM-IMPEX INTERNATIONAL | 1279 | non-ionic surfactant |
| XTT cell viability reagent |
References
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
- Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
- Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
- Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
- Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
- Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
- Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
- Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
- Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
- Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
- Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
- Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
- Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
- Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), 1425-1442 (2012).
- Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
- Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
- Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
- Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
- Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
- Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system – CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
- Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
- Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
- Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
- Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
- Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
- Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
- Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
- Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
- Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
- Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
- Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
- Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
- Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
- Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
- Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , (1999).
- Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
- Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
- David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
- Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
- Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
- Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
- Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
- Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
- Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).
