JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Изготовление магнитных платформ для микрон-масштабной организации взаимосвязанных нейронов

Published: July 14, 2021
doi:
10.3791/62013
, , , , , , , ,
1Department of Physics,Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering,Bar-Ilan University, 3Department of chemistry,Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials,Bar-Ilan University

Summary

В данной работе представлен восходящий подход к проектированию локальных магнитных сил для управления организацией нейронов. Нейроноподобные клетки, загруженные магнитными наночастицами (MNPs), покрыты сверху и контролируются микроструктурированной платформой с перпендикулярной намагниченностью. Также описаны магнитные характеристики, поглощение клеток MNP, жизнеспособность клеток и статистический анализ.

Abstract

Способность направлять нейроны в организованные нейронные сети имеет большое значение для регенеративной медицины, тканевой инженерии и био-сопряжения. Многие исследования были направлены на направление нейронов с использованием химических и топографических сигналов. Однако отчеты об организационном контроле в микроном масштабе над большими площадями скудны. Здесь был описан эффективный метод размещения нейронов в заданных местах и управления нейронным выростом с разрешением в микроновом масштабе с использованием магнитных платформ, встроенных в микроструктурированные магнитные элементы. Было продемонстрировано, что загрузка нейронов магнитными наночастицами (MNPs) превращает их в чувствительные магнитные единицы, на которые могут влиять магнитные градиенты. Следуя этому подходу, была изготовлена уникальная магнитная платформа, на которой клетки PC12, общая нейроноподобная модель, были покрыты и загружены суперпарамагнитными наночастицами. Тонкие пленки ферромагнитных (FM) многослойных (FM) со стабильной перпендикулярной намагниченностью были нанесены для обеспечения эффективных сил притяжения к магнитным паттернам. Эти ячейки PC12, нагруженные MNP, покрытые и дифференцированные на магнитных платформах, были предпочтительно прикреплены к магнитным паттернам, а рост нейритов был хорошо выровнен с формой шаблона, образуя ориентированные сети. Представлены методы количественной характеристики магнитных свойств, поглощения клеточного MNP, жизнеспособности клеток и статистического анализа результатов. Этот подход позволяет контролировать формирование нейронных сетей и улучшает интерфейс нейрон-электрод посредством манипулирования магнитными силами, что может быть эффективным инструментом для исследований сетей in vitro и может предложить новые терапевтические направления биосовмещивания.

Introduction

Микроструктурирование нейронов обладает большим потенциалом для регенерации тканей1,2,3,4,5 и развития нейроэлектронных устройств6,7,8. Однако микрон-масштабное позиционирование нейронов при высоком пространственном разрешении, как в биологических тканях, представляет собой значительную проблему. Формирование заранее спроектированных структур в этом масштабе требует руководства процессами нервных клеток путем локального контроля подвижности сомы и роста аксональных образований. Предыдущие исследования предполагали использование химических и физических сигналов9,10,11,12 для управления ростом нейронов. Здесь новый подход фокусируется на управлении позиционированием ячеек с помощью градиентов магнитного поля13,14,15,16,17,превращая ячейки, загруженные MNPs, в магнитно-чувствительные блоки, которыми можно дистанционно манипулировать.

Kunze et al., которые охарактеризовали силу, необходимую для индуцирования клеточных реакций с использованием магнитных чип- и MNP-нагруженных ячеек, доказали, что раннее аксональное удлинение может быть вызвано механическим напряжением внутри ячеек18. Tay et al. подтвердили, что микрофабрикованные подложки с усиленными градиентами магнитного поля позволяют проводить беспроводную стимуляцию нейронных цепей, дозированных МНП с использованием кальциевых индикаторных красителей19. Более того, Tseng et al. объединили наночастицы внутри клеток, что привело к локализованным наночастицам-опосредованным силам, которые приблизились к клеточному напряжению20. Это привело к изготовлению определенных паттернов микромагнитных подложек, которые помогли изучить клеточный ответ на механические силы. Клеточное напряжение, возникающее при приложении локализованных сил, опосредованных наночастицами, достигалось путем объединения наночастиц внутри клеток20. Комплементарная металлооксидная полупроводниковая (КМОП)-микрофлюидная гибридная система была разработана Ли и др., которые внедрили массив микроэлектромагнитов в КМОП-чип для управления движением отдельных ячеек, помеченных магнитными шариками21.

Alon et al. использовали микромасштабные, предварительно запрограммированные, магнитные площадки в качестве магнитных «горячих точек» для определения местоположения клеток22. Специфическая активность также может быть стимулирована внутри клеток с использованием микроструктурированных магнитных массивов для локализации наночастиц в определенных субклеточных местах23. Клеточное поглощение MNP было успешно продемонстрировано в первичных нейронах пиявок, крыс и мышей24,25,26. Здесь это было продемонстрировано на клеточной линии феохромоцитомы крыс PC12, которая, как сообщалось ранее, показывает высокое поглощение MNPs27. В последние годы существуют различные медицинские применения МП, включая доставку лекарств и термотерапию в лечении рака28,29,30,31. В частности, исследования касаются применения МНП и нейронных сетей32,33,34,35. Однако магнитная организация нейронов с использованием МНФ на одноклеточном уровне заслуживает дальнейшего изучения.

В этой работе был описан подход «снизу вверх» для создания локальных магнитных сил через заранее спроектированные платформы для управления расположением нейронов. Представлено изготовление микроновых узоров FM-многослойных. Эта уникальная многослойная структура FM создает стабильную перпендикулярную намагниченность, которая приводит к эффективным силам притяжения ко всем магнитным паттернам. Посредством инкубации МНП загружались в ячейки PC12, превращая их в магниточувствительные единицы. MNP-нагруженные ячейки, покрытые и дифференцированные на магнитных платформах, были предпочтительно прикреплены к магнитным паттернам, а нейритовый рост был хорошо выровнен с формой шаблона, образуя ориентированные сети. Было описано несколько методов для характеристики магнитных свойств МНОГОСЛОЙНЫХ FM-матриц и МНП, а также были представлены методы анализа клеточного поглощения MNP и жизнеспособности клеток. Дополнительно детализированы морфометрические параметры роста нейронов и статистический анализ результатов.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все биологические реакции в шкафу биобезопасности. 1. Изготовление магнитной платформы литография Разрежьте стеклянные слайды на 2 х2 см2 с помощью ручки писца. Очистите стекло ацетоном, а затем изопропанолом в течение 5 минут каждый в…

Representative Results

Изготовлены магнитные платформы с различными геометрическими формами(рисунок 1А). Магнитные паттерны осаждались путем напыления: 14 многослойных Co80Fe20 и Pd, 0,2 нм и 1 нм соответственно. Электронная микроскопия показала, что общая высота магнит?…

Discussion

Репрезентативные результаты демонстрируют эффективность представленной методологии контроля и организации формирования нейронных сетей в микроновом масштабе. Ячейки PC12 с MNP-нагрузкой оставались жизнеспособными и были преобразованы в магниточувствительные единицы, которые притяги…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Министерством науки и технологий Израиля и Израильским научным фондом (569/16).

Materials

16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 15710
6-well cell culture plate FALCON 353846
96-well cell culture plate SPL life sciences 30096
Amphotericin B solution Biological Industries 03-028-1B
AZ 1514H photoresist MicroChemicals GmbH
AZ 351 B developer MicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA) Biological Industries 03-010-1B
Cell and Tissue cultur flask Biofil TCF002250 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dish Greiner Bio-One 627-160 35 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based) Biological Industries 20-300-1000
Centrifuge tube Biofil CFT021500 50 mL
Co80Fe20 at% sputter target ACI Alloys 99.95%
Collagen type I Corning Inc. 354236 Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscope Leica TCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-165-152
DAPI fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Disposable needle KDL 23 G
Disposable  syringe Medispo 1160227640 10 mL
Donor horse serum Biological Industries 04-124-1A
ELISA reader Merk Millipore BioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70% ROMICAL LTD 19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated) Biolab-chemicals 52505
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
Fresh murine β-NGF Peprotech 450-34
GMW C-frame electromagnet . Buckley systems LTD 3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32% DAEJUNG CHEMICAL & METALS 4170-4100
ImageJ US National Institutes of Health, Bethesda NeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP) Ametek Spectro SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measure Keithley 2400
Keithley switching system Keithley 3700
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Light microscope Leica DMIL LED
Maskless photolithography Heidelberg Inst. MLA150
Microscope Slides BAR-NAOR BN1042000C
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 438073
Normal donkey serum (NDS) Sigma D9663
PBS 10x hylabs BP507/1LD
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Pd sputter target ACI Alloys 99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solution Biological Industries 03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagent Molecular probes A-13261 resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulin Santa Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering system Orion AJA Int. Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamine Biological Industries 01-100-1A
Sonication bath KUDOS SK3210HP Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometer Quantum Design, CA
Triton X-100 CHEM-IMPEX INTERNATIONAL 1279 non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system – CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).

Tags

Keywords: Magnetic PlatformsMicron-scale OrganizationInterconnected NeuronsNeural Network FormationMagnetic ManipulationsIn Vitro StudiesBiointerfacing DevicesMagnetic NanoparticlesPhotolithographyFerromagnetic Multilayers
check_url/62013?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., Vardi, N., Marcus, M., Smith, A., Margel, S., Shefi, O., Sharoni, A. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (173), e62013, doi:10.3791/62013 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image