상호 연결된 뉴런의 마이크론 규모의 조직을 위한 자기 플랫폼 제작
Summary
이 작품은 신경 조직의 제어를위한 지역 자기력의 엔지니어링에 상향 식 접근 방식을 제시한다. 자기 나노 입자 (MNPs)로로드 된 뉴런 과 같은 세포는 수직 자화와 마이크로 패턴 플랫폼에 의해 도금및 제어됩니다. 또한 자기 특성화, MNP 세포 섭취, 세포 생존 가능성 및 통계 분석이 설명되어 있습니다.
Abstract
조직 된 신경망으로 뉴런을 직접 하는 능력은 재생 의학에 대 한 큰 의미를 가지고, 조직 공학, 그리고 바이오 인터페이싱. 많은 연구는 화학 및 지형 단서를 사용 하 여 신경 세포를 지시 하는 것을 목표로. 그러나, 넓은 지역에 미크론 규모에 조직 통제의 보고는 부족합니다. 여기서, 마이크로 패턴, 자기 원소에 내장된 자기 플랫폼을 사용하여 미리 설정된 부위에 뉴런을 배치하고 미크로네 스케일 해상도로 뉴런 아웃성장을 유도하는 효과적인 방법이 설명되었습니다. 자기 나노 입자 (MNP)를 가진 뉴런을 적재하는 것은 자기 그라데이션에 의해 영향을 받을 수 있는 민감한 자기 단위로 변환한다는 것을 보여주었습니다. 이 접근법에 따라, 일반적인 뉴런과 같은 모델인 PC12 세포가 도금되고 초파라자성 나노 입자로 로드되는 독특한 자기 플랫폼이 제작되었습니다. 안정적인 수직 자화를 가진 강자성(FM) 다층의 박막이 증착되어 자기 패턴을 향한 효과적인 어트랙션력을 제공하도록 증착되었다. 이러한 MNP 로드 PC12 셀은 자기 플랫폼 위에 도금및 분화되어 자기 패턴에 우선적으로 부착되었으며, 중성염 아웃성장이 패턴 형상과 잘 정렬되어 지향 네트워크를 형성하였다. 자기 특성의 정량적 특성화 방법, 세포 MNP 섭취량, 세포 생존가능성 및 결과의 통계적 분석이 제시된다. 이 접근법은 신경망 형성의 제어를 가능하게하고 자기력의 조작을 통해 신경-전극 인터페이스를 향상, 이는 네트워크의 체외 연구를위한 효과적인 도구가 될 수 있으며 새로운 치료 생체 통합 방향을 제공 할 수 있습니다.
Introduction
뉴런의 마이크로패턴은 조직 재생1,2,3,4,5 및 신경전자기기6,7,8의개발에 큰 잠재력을 지니고 있다. 그러나 생물학적 조직에서와 같이 높은 공간 해상도에서 뉴런의 미크론 스케일 포지셔닝은 중요한 과제를 제기합니다. 이 규모에 미리 디자인된 구조물을 형성하는 것은 현지으로 소마 운동성 및 축축한 성장을 통제하여 신경 세포 프로세스의 지도가 필요합니다. 이전 연구는 화학 및 물리적 단서의사용을 제안9,10,11,12 신경 성장을 안내하기위한. 여기서, 새로운 접근법은자기장 그라데이션(13,14,15,16,17)에의한 세포 포지셔닝을 제어하여 원격으로 조작할 수 있는 자기 민감성 단위로 MPP를 탑재하는 세포를 선회하는 데 초점을 맞추고 있다.
마그네틱 칩 및 MNP 로드 셀을 사용하여 세포 반응을 유도하는 데 필요한 힘을 특징으로 하는 Kunze 등은 세포 내부의 기계적 장력에 의해 초기 축하 신장을 유발할 수 있음을입증하였다(18). Tay 등은 향상된 자기장 그라데이션을 갖춘 미세 가공 기판이 칼슘 표시기염료(19)를사용하여 MP와 함께 투제된 신경 회로의 무선 자극을 허용한다는 것을 확인하였다. 더욱이, Tseng 외. 세포 내부의 나노 입자를 결합하여 세포장력(20)에접근하는 국소화된 나노입자 매개 력을 초래하였다. 이것은 기계적 힘에 세포 반응을 공부하는 것을 도운 마이크로 자기 기판의 정의된 패턴의 제조로 이끌어 냈습니다. 국소화된 나노입자 매개력의 적용으로부터 발생하는 세포장력은세포(20)내의 나노입자를 결합함으로써 달성되었다. 상보금속 산화물 반도체(CMOS)-미세유체 하이브리드 시스템은 CMOS 칩에 마이크로 전자석 배열을 내장하여 자기비드(21)로태그된 개별 세포의 움직임을 제어하는 이외 에 의해 개발되었다.
Alon 외. 마이크로 스케일, 미리 프로그래밍 된 자기 패드를 자기 “핫스팟”으로 사용하여 세포(22)를찾습니다. 특정 활성은 또한 특정 세포립23에서나노 입자를 국소화하기 위해 마이크로 패턴 자기 배열을 사용하여 세포 내에서 자극 될 수있다. 셀룰러 MNP 섭취량은 거머리, 쥐 및 마우스 기본 뉴런24,25,26에서성공적으로 입증되었다. 여기서, 이것은 이전에 MPNPs27의높은 upup을 보여주기 위하여 보고된 쥐 PC12 pheochromocytoma 세포주에서 입증되었습니다. 최근에는 암 치료제28,29,30,31에서약물 전달 및 열요법을 포함한 다양한 의료 응용 프로그램이 있었습니다. 구체적으로, 연구는 MP와 뉴런 네트워크32,33,34, 35의응용프로그램을다룹니다. 그러나, 단일 세포 수준에서 의원을 사용 하 여 뉴런의 자기 조직 추가 조사를 받을 자격이.
이 작품에서, 상향식 접근 방식은 신경 배열을 제어하기 위한 미리 디자인된 플랫폼을 통해 현지 자기력을 설계하기 위하여 기술되었습니다. FM 다층의 미크로네 스케일 패턴의 제조가 제시되었습니다. 이 독특한 FM 다층 구조는 안정적인 수직 자화를 만들어 모든 자기 패턴에 대한 효과적인 어트랙션 력을 초래합니다. 인큐베이션을 통해 MP는 PC12 세포에 로드되어 자기 에 민감한 장치로 변형시켰습니다. MNP 로드 된 세포, 도금 및 자기 플랫폼 위에 분화, 자기 패턴에 우선적으로 부착되었고, neurite 아웃 성장은 패턴 모양과 잘 정렬되어 지향 네트워크를 형성하였다. FM 다층 및 MP의 자기 특성을 특성화하기 위해 여러 가지 방법이 기재되었으며, 세포 MNP 섭취량 및 세포 생존 가능성 감수성에 대한 기술도 제시되었다. 또한, 뉴런 성장의 형태학적 매개 변수와 결과의 통계 적 분석은 상세하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
대표적인 결과는 미크로네 규모의 신경망 형성을 제어하고 조직하기 위한 제시된 방법론의 효과를 입증한다. MNP로드 PC12 세포는 실행 가능한 상태로 남아 있으며 FM 전극에서 특정 부위로 자기 힘에 매료된 자기 민감성 장치로 변형되었습니다. 이것은 세포가 얇은 선이 아닌 육각형의 더 큰 정점에게 우선적으로 부착된 그림 5C에서가장 잘 설명됩니다. 더욱이, 세포의 분기는…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 과학 기술부, 이스라엘, 그리고 이스라엘 과학 재단 (569/16)에 의해 지원되었다.
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 15710 | |
| 6-well cell culture plate | FALCON | 353846 | |
| 96-well cell culture plate | SPL life sciences | 30096 | |
| Amphotericin B solution | Biological Industries | 03-028-1B | |
| AZ 1514H photoresist | MicroChemicals GmbH | ||
| AZ 351 B developer | MicroChemicals GmbH | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Biological Industries | 03-010-1B | |
| Cell and Tissue cultur flask | Biofil | TCF002250 | 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One | 627-160 | 35 mm |
| Cell Proliferation Kit (XTT-based) | Biological Industries | 20-300-1000 | |
| Centrifuge tube | Biofil | CFT021500 | 50 mL |
| Co80Fe20 at% sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
| Collagen type I | Corning Inc. | 354236 | Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-165-152 | |
| DAPI fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Disposable needle | KDL | 23 G | |
| Disposable syringe | Medispo | 1160227640 | 10 mL |
| Donor horse serum | Biological Industries | 04-124-1A | |
| ELISA reader | Merk Millipore | BioTek synergy 4 hybrid microplate reader | |
| Ethanol 70% | ROMICAL LTD | 19-009102-80 | |
| Ethanol absolute (Dehydrated) | Biolab-chemicals | 52505 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| Fresh murine β-NGF | Peprotech | 450-34 | |
| GMW C-frame electromagnet . | Buckley systems LTD | 3470, 45 mm | |
| Hydrochloric acid 32% | DAEJUNG CHEMICAL & METALS | 4170-4100 | |
| ImageJ | US National Institutes of Health, Bethesda | NeuronJ plugin | |
| Inductively coupled plasma (ICP) | Ametek Spectro | SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma | |
| Keithley source-measure | Keithley | 2400 | |
| Keithley switching system | Keithley | 3700 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Light microscope | Leica | DMIL LED | |
| Maskless photolithography | Heidelberg Inst. | MLA150 | |
| Microscope Slides | BAR-NAOR | BN1042000C | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 438073 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Sigma | D9663 | |
| PBS 10x | hylabs | BP507/1LD | |
| PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
| Pd sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
| Penicillin-streptomycin nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| PrestoBlue cell viability reagent | Molecular probes | A-13261 | resazurin-based |
| Rabbit antibody to α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | ||
| RF magnetron sputtering system | Orion AJA Int. | Orion 8 | |
| RPMI 1640 with l-glutamine | Biological Industries | 01-100-1A | |
| Sonication bath | KUDOS | SK3210HP | Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W |
| SQUID magnetometer | Quantum Design, CA | ||
| Triton X-100 | CHEM-IMPEX INTERNATIONAL | 1279 | non-ionic surfactant |
| XTT cell viability reagent |
References
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
- Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
- Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
- Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
- Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
- Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
- Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
- Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
- Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
- Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
- Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
- Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
- Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
- Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), 1425-1442 (2012).
- Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
- Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
- Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
- Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
- Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
- Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system – CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
- Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
- Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
- Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
- Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
- Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
- Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
- Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
- Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
- Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
- Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
- Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
- Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
- Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
- Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
- Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , (1999).
- Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
- Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
- David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
- Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
- Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
- Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
- Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
- Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
- Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).
