Fabrikasjon av magnetiske plattformer for mikron-skala organisering av sammenkoblede nevroner
Summary
Dette arbeidet presenterer en nedenfra-og-opp-tilnærming til prosjektering av lokale magnetiske krefter for kontroll av nevronisk organisering. Nevronlignende celler lastet med magnetiske nanopartikler (MNPer) er belagt på toppen og styres av en mikromønstret plattform med vinkelrett magnetisering. Også beskrevet er magnetisk karakterisering, MNP cellulært opptak, celle levedyktighet og statistisk analyse.
Abstract
Evnen til å lede nevroner inn i organiserte nevrale nettverk har store implikasjoner for regenerativ medisin, vevsteknikk og bio-grensesnitt. Mange studier har som mål å lede nevroner ved hjelp av kjemiske og topografiske signaler. Rapporter om organisatorisk kontroll på mikron-skala over store områder er imidlertid knappe. Her er det beskrevet en effektiv metode for å plassere nevroner på forhåndsinnstilte steder og veilede nevronal utvekst med mikron-skala oppløsning, ved hjelp av magnetiske plattformer innebygd med mikromønstrede, magnetiske elementer. Det har blitt demonstrert at lasting av nevroner med magnetiske nanopartikler (MNPer) konverterer dem til sensitive magnetiske enheter som kan påvirkes av magnetiske gradienter. Etter denne tilnærmingen har en unik magnetisk plattform blitt fabrikkert på hvilke PC12-celler, en vanlig nevronlignende modell, ble belagt og lastet med superparamagnetiske nanopartikler. Tynne filmer av ferromagnetiske (FM) flerlagsmotorer med stabil vinkelrett magnetisering ble avsatt for å gi effektive tiltrekningskrefter mot de magnetiske mønstrene. Disse MNP-lastede PC12-cellene, belagt og differensiert på toppen av de magnetiske plattformene, ble fortrinnsvis festet til de magnetiske mønstrene, og nevrittutveksten var godt tilpasset mønsterformen og dannet orienterte nettverk. Kvantitative karakteriseringsmetoder for magnetiske egenskaper, cellulært MNP-opptak, celle levedyktighet og statistisk analyse av resultatene presenteres. Denne tilnærmingen muliggjør kontroll av nevral nettverksdannelse og forbedrer nevron-til-elektrode-grensesnittet gjennom manipulering av magnetiske krefter, noe som kan være et effektivt verktøy for in vitro-studier av nettverk og kan tilby nye terapeutiske biointerfacing retninger.
Introduction
Mikropattering av nevroner har stort potensial for vevregenerering1,2,3,4,5 og utvikling av nevro-elektroniske enheter6,7,8. Imidlertid utgjør den mikron-skalerte posisjoneringen av nevroner med høy romlig oppløsning, som i biologisk vev, en betydelig utfordring. Å danne predesignede strukturer i denne skalaen krever veiledning av nervecelleprosesser ved å lokalt kontrollere soma motilitet og axonal utvekst. Tidligere studier har antydet bruk av kjemiske og fysiske signaler9,10,11,12 for å veilede nevronvekst. Her fokuserer en ny tilnærming på å kontrollere celleposisjonering ved magnetiske feltgradienter13,14,15,16,17, snu celler lastet med MNPer til magnetiske sensitive enheter, som kan manipuleres eksternt.
Kunze et al., som karakteriserte kraften som trengs for å indusere cellulære responser ved hjelp av magnetiske chip- og MNP-ladede celler, viste at tidlig axonal forlengelse kan utløses av mekanisk spenning inne i celle18. Tay et al. bekreftet at mikro-fabrikkerte substrater med forbedrede magnetiske feltgradienter gir mulighet for trådløs stimulering av nevrale kretser dosert med MNPer ved hjelp av kalsiumindikatorfargestoffer19. Videre samlet Tseng et al. sammenknyttede nanopartikler inne i celler, noe som resulterte i lokaliserte nanopartikkelmediert krefter som nærmet seg cellulær spenning20. Dette førte til fabrikasjon av definerte mønstre av mikromagnetiske substrater som bidro til å studere cellulær respons på mekaniske krefter. Cellulær spenning som oppstår ved bruk av lokaliserte nanopartikkelmedierte krefter ble oppnådd ved å samle nanopartikler i celle20. Et komplementært metalloksid halvleder (CMOS)-mikrofluidisk hybridsystem ble utviklet av Lee et al. som innebygd en rekke mikroelektromagneter i CMOS-brikken for å kontrollere bevegelsen til individuelle celler merket med magnetiske perler21.
Alon et al. brukte mikroskala, forhåndsprogrammerte, magnetiske pads som magnetiske “hot spots” for å finne cellene22. Spesifikk aktivitet kan også stimuleres i celler ved hjelp av mikromønstrede magnetiske matriser for å lokalisere nanopartikler på bestemte subcellulære steder23. Cellulært MNP-opptak har blitt demonstrert i leech, rotte og mus primære nevroner24,25,26. Her har dette blitt demonstrert på en rotte PC12 pheochromocytoma cellelinje, som tidligere har blitt rapportert å vise høyt opptak av MNPs27. De siste årene har det vært ulike medisinske anvendelser av MNPer, inkludert legemiddellevering og termoterapi i kreftbehandlinger28,29,30,31. Spesielt håndterer studier anvendelsen av MNPer og nevronnettverk32,33,34,35. Imidlertid fortjener den magnetiske organiseringen av nevroner som bruker MNPer på et enkeltcellet nivå videre undersøkelse.
I dette arbeidet har en nedenfra-og-opp-tilnærming blitt beskrevet for å konstruere lokale magnetiske krefter via forhåndsdesignede plattformer for å kontrollere nevronarrangement. Fabrikasjonen av mikron-skala mønstre av FM flerlags har blitt presentert. Denne unike, FM flerlags strukturen skaper stabil vinkelrett magnetisering som resulterer i effektive tiltrekningskrefter mot alle magnetiske mønstre. Via inkubasjon ble MNPer lastet inn i PC12-celler, og forvandlet dem til magnetiske sensitive enheter. MNP-lastede celler, belagt og differensiert på toppen av de magnetiske plattformene, ble fortrinnsvis festet til de magnetiske mønstrene, og nevrittutveksten var godt tilpasset mønsterformen og dannet orienterte nettverk. Flere metoder har blitt beskrevet for å karakterisere de magnetiske egenskapene til FM-flerlags- og MNP-ene, og teknikker for cellulære MNP-opptak og celle levedyktighetsanalyser har også blitt presentert. I tillegg er morfometriske parametere for nevronvekst og statistisk analyse av resultatene detaljert.
Protocol
Representative Results
Discussion
De representative resultatene viser effektiviteten av den presenterte metodikken for å kontrollere og organisere nevronal nettverksdannelse i mikronskala. De MNP-lastede PC12-cellene forble levedyktige og ble forvandlet til magnetiske sensitive enheter som ble tiltrukket av magnetkreftene fra FM-elektrodene til bestemte steder. Dette er best demonstrert i figur 5C, der cellene fortrinnsvis festet seg til de større toppunktene i sekskantene og ikke de tynne linjene. Videre utviklet forgreni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av Vitenskaps- og teknologidepartementet, Israel, og av Den israelske vitenskapsstiftelsen (569/16).
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 15710 | |
| 6-well cell culture plate | FALCON | 353846 | |
| 96-well cell culture plate | SPL life sciences | 30096 | |
| Amphotericin B solution | Biological Industries | 03-028-1B | |
| AZ 1514H photoresist | MicroChemicals GmbH | ||
| AZ 351 B developer | MicroChemicals GmbH | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Biological Industries | 03-010-1B | |
| Cell and Tissue cultur flask | Biofil | TCF002250 | 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One | 627-160 | 35 mm |
| Cell Proliferation Kit (XTT-based) | Biological Industries | 20-300-1000 | |
| Centrifuge tube | Biofil | CFT021500 | 50 mL |
| Co80Fe20 at% sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
| Collagen type I | Corning Inc. | 354236 | Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-165-152 | |
| DAPI fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Disposable needle | KDL | 23 G | |
| Disposable syringe | Medispo | 1160227640 | 10 mL |
| Donor horse serum | Biological Industries | 04-124-1A | |
| ELISA reader | Merk Millipore | BioTek synergy 4 hybrid microplate reader | |
| Ethanol 70% | ROMICAL LTD | 19-009102-80 | |
| Ethanol absolute (Dehydrated) | Biolab-chemicals | 52505 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| Fresh murine β-NGF | Peprotech | 450-34 | |
| GMW C-frame electromagnet . | Buckley systems LTD | 3470, 45 mm | |
| Hydrochloric acid 32% | DAEJUNG CHEMICAL & METALS | 4170-4100 | |
| ImageJ | US National Institutes of Health, Bethesda | NeuronJ plugin | |
| Inductively coupled plasma (ICP) | Ametek Spectro | SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma | |
| Keithley source-measure | Keithley | 2400 | |
| Keithley switching system | Keithley | 3700 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Light microscope | Leica | DMIL LED | |
| Maskless photolithography | Heidelberg Inst. | MLA150 | |
| Microscope Slides | BAR-NAOR | BN1042000C | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 438073 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Sigma | D9663 | |
| PBS 10x | hylabs | BP507/1LD | |
| PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
| Pd sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
| Penicillin-streptomycin nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| PrestoBlue cell viability reagent | Molecular probes | A-13261 | resazurin-based |
| Rabbit antibody to α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | ||
| RF magnetron sputtering system | Orion AJA Int. | Orion 8 | |
| RPMI 1640 with l-glutamine | Biological Industries | 01-100-1A | |
| Sonication bath | KUDOS | SK3210HP | Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W |
| SQUID magnetometer | Quantum Design, CA | ||
| Triton X-100 | CHEM-IMPEX INTERNATIONAL | 1279 | non-ionic surfactant |
| XTT cell viability reagent |
References
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
- Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
- Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
- Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
- Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
- Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
- Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
- Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
- Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
- Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
- Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
- Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
- Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
- Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), 1425-1442 (2012).
- Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
- Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
- Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
- Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
- Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
- Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system – CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
- Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
- Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
- Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
- Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
- Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
- Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
- Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
- Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
- Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
- Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
- Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
- Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
- Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
- Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
- Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , (1999).
- Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
- Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
- David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
- Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
- Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
- Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
- Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
- Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
- Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).
