اقتران كيميائي لأجسام مضادة منقية DEC-205 موجهة مع بروتين كامل الطول لاستهداف الخلايا التشجرية الماوس في المختبر وفي فيفو
Summary
نحن نصف بروتوكولا للتلازم الكيميائي لنموذج مستضد ovalbumin إلى الأجسام المضادة مستقبلات الغدد الصماء محددة لاستهداف الخلايا في الجسم الحي التغصني. ويشمل البروتوكول تنقية الأجسام المضادة، والتحواز الكيميائي للمضاد، فضلا عن تنقية المترافق والتحقق من كفاءة التواؤم.
Abstract
يؤدي تسليم المستضد المستهدف إلى الخلايا التغصنية المتقاطعة في الجسم الحي بكفاءة إلى تحفيز استجابات الخلايا التأثيرية T ويعرض نهجا قيما في تصميم اللقاح. يتم تسليم مستضد إلى العاصمة عن طريق الأجسام المضادة محددة لمستقبلات الغدد الصماء مثل DEC-205 التي تحفز امتصاص, تجهيز, وMHC فئة I- و II-العرض.
يعد اقتران المستضد المطلوب بكفاءة وموثوقية بأجسام مضادة مناسبة خطوة حاسمة في استهداف DC ، ومن بين عوامل أخرى يعتمد على شكل المستضد. يعد اقتران البروتين الكامل الطول بالأجسام المضادة النقية استراتيجية ممكنة. في الماضي، أنشأنا بنجاح الربط المتبادل بين نموذج مستضد ovalbumin (OVA) والأجسام المضادة IgG2a DEC-205 محددة (αDEC-205) لدراسات استهداف في الجسم الحي DC في الفئران. الخطوة الأولى من البروتوكول هي تنقية الجسم المضاد من الناتات من NLDC (الخلايا التشعبية غير اللمفاوية)-145 الورم الهجين عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب. يتم تنشيط الأجسام المضادة المنقى للتضمين الكيميائي بواسطة sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] سيكلوهيكسان-1-كاربوكسيلات) وفي الوقت نفسه تتعرض مجموعات سلفهيدريل من بروتين OVA من خلال الحضانة مع TCEP-HCl (ثلاثيات (2-carboxyethyl) فوسفين هيدروكلوريد). تتم إزالة فائض TCEP-HCl وs sulfo-SMCC ويتم خلط المستضد مع الأجسام المضادة المنشطة للاقتران بين عشية وضحاها. ويتركز الناتج αDEC-205/OVA اقتران وتحريرها من OVA غير منضم. يتم التحقق من نجاح اقتران OVA إلى αDEC-205 من خلال تحليل البقع الغربية واختصاص المناعة المرتبط بالإنزيم (ELISA).
لقد استخدمنا بنجاح αDEC-205/OVA المترابط كيميائيا للحث على استجابات الخلايا التائية السامة للخلايا في الكبد ومقارنة المساعدين المختلفين لإمكاناتهم في تحفيز المناعة الفكاهية والخلوية التالية في استهداف الجسم الحي ل DEC-205+ DC. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الأجسام المضادة/المستضدات المقترنة كيميائيا توفر أدوات قيمة لتحريض استجابات اللقاح الفعالة على مستضدات الأورام، وقد ثبت أنها متفوقة على نهج التحصين الكلاسيكية فيما يتعلق بالوقاية والعلاج من مختلف أنواع الأورام.
Introduction
الخلايا التشجرية (DC) هي لاعبين مركزيين في الجهاز المناعي. فهي مجموعة متنوعة من الخلايا المتخصصة في عرض المستضد ووظيفتها الرئيسية هي جسر المناعة الفطرية والتكيفية1،2. الأهم من ذلك، العاصمة لا تلعب دورا هاما في الاستجابات الموجهة مسببات الأمراض كفاءة ومحددة ولكن تشارك أيضا في العديد من جوانب مناعة مضادة للورم1،3.
نظرا لدورها الحصري في مناعة المضيف ، ظهرت DC في التركيز كخلايا مستهدفة للتطعيم4. نهج واحد هو استهداف المستضدات إلى العاصمة في الجسم الحي للحث على الاستجابات المناعية الخاصة بالمستضد وعلى مدى السنوات الماضية ، تم تخصيص عدد كبير من الدراسات لتحديد المستقبلات المناسبة واستراتيجيات الاستهداف1،4. مثال واحد هو مستقبلات الليكتين من النوع C DEC-205 ، والتي يمكن استهدافها من قبل الأجسام المضادة الخاصة ب DEC-205 للحث على الإصابة بداء الغدد الصماء. الأهم من ذلك، DEC-205 استهداف في تركيبة مع المساعدين مناسبة وقد ثبت أن تحفز بكفاءة CD4 طويلة الأمد وحامية+ وCD8+ الخلايا التائية، فضلا عن استجابات الأجسام المضادة، وأيضا ضد مستضدات الورم3،5،6،7،8،9.
هناك عدد من الدراسات التي تبين مستضدات مترافقة تستهدف العاصمة لتكون متفوقة على مستضد غير مترافق الحرة3،5،10،11،12. وهذا يجعل من اقتران مستضد العاصمة المعنية استهداف moiety خطوة مركزية في العاصمة نهج الاستهداف. في حالة استهداف DC عن طريق الأجسام المضادة أو شظايا الأجسام المضادة ، يمكن ربط المستضدات إما كيميائيا أو وراثيا ، وتوفر أي من الاستراتيجيتين مزاياها الخاصة (dis)1. من ناحية، في الأجسام المضادة المعدلة وراثيا-مستضد يبني هناك سيطرة على جرعة مستضد، فضلا عن موقع توفير مقارنة متفوقة بين الكثير1. ومع ذلك، في الوقت نفسه، يحتاج التقارن الكيميائي إلى إعداد أقل ويوفر مرونة أكبر خاصة عند محاولة اختبار ومقارنة المستضدات المختلفة و/ أو استراتيجيات التطعيم في النماذج التجريبية وما قبل السريرية.
هنا، نقدم بروتوكولا للتاؤم الكيميائي الفعال والموثوق به لل ovalbumin (OVA) كمضاد بروتين نموذجي لأجسام IgG2a المضادة الخاصة ب DEC-205 (αDEC-205) المناسبة لاستهداف في الجسم الحي DC في الفئران. أولا، يتم تنقية αDEC-205 من NLDC-145 خلايا الورم الهجين13. بالنسبة للترابط الكيميائي، يتم استخدام السيكلوهيكسان-1-كاربوكسيلات (sulfo-SMCC)، الذي يحتوي على مجموعات إستر وماليميد (N-hydroxysuccinimide) NHS (N-hydroxysuccinimide)، مما يسمح بالارتقاق التساهمي للجزيئات المحتوية على الأمين والسولفيدريل. على وجه التحديد ، فإن الأمينات الأولية للأجسام المضادة تتفاعل في البداية مع sulfo-SMCC وما ينتج عن ذلك من ماليميد تنشيط αDEC-205 ثم يتفاعل مع بروتين OVA المحتوي على سلفدريل خفضت من خلال TCEP-HCl (تريس (2-carboxyethyl) فوسفين هيدروكلوريد). المنتج النهائي هو αDEC-205/OVA(الشكل 1). وإلى جانب التضمين الكيميائي نفسه، يصف بروتوكولنا إزالة OVA الزائدة من المترافقة وكذلك التحقق من التوازج الناجح من خلال تحليل البقع الغربية واختبار معين للمناعة مرتبط بالإنزيم. لقد نجحنا في استخدام هذا النهج في الماضي لإقتران OVA كيميائيا والبروتينات الأخرى أو الببتيدات المناعية إلى αDEC-205. نحن نظهر كفاءة ملزمة لCD11c+ الخلايا في المختبر، فضلا عن التعريفي كفاءة المناعة الخلوية والفكاهية في الجسم الحي.
بالتأكيد ، هناك عيوب في هذه الطريقة مثل قابلية المقارنة بين الكثير والكثير وفي ال دوسينج الدقيق للمضاد داخل المترافق النهائي. ومع ذلك ، يوفر التقارن الكيميائي مرونة تجريبية في اختيار الجسم المضاد واستضاد البروتين بالمقارنة مع البنى المعدلة وراثيا. لذلك ، نعتقد أن هذا النهج ذو قيمة خاصة في تقييم المستضدات المختلفة لكفاءتها في استهداف DC في نماذج الماوس قبل السريرية ، والأهم من ذلك أيضا في سياق استجابات مناعية محددة مضادة للورم.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر التلازم الكيميائي للأجسام المضادة الخاصة بمستقبلات الغدد الصماء ومستضد البروتين نهجا فعالا ، والأهم من ذلك ، مرنا أيضا لاستهداف vivo DC في نماذج الماوس قبل السريرية. مع بروتوكولنا نقدم نهجا فعالا لنجاح اقتران نموذج مستضد OVA إلى الأجسام المضادة IgG DEC-205 محددة.
في بروتو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفان س. بريتين على المساعدة التقنية الخبيرة. وقد تم دعم هذا العمل بمنحة من جمعية هيلمهولتز لمراكز البحوث الألمانية (HGF) التي تم توفيرها كجزء من تحالف هيلمهولتز “العلاج المناعي للسرطان” (HCC_WP2b).
Materials
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 – 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 – 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 – 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 – 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
References
- Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
- Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines–hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
- Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
- Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
- Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
- Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
- Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
- Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
- Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
- Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
- Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans’ cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
- Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).
