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Cancer Research

Conjugação Química de um anticorpo purificado DEC-205-Directed com proteína de comprimento completo para direcionar células dendríticas de camundongos in vitro e in vivo

Published: February 5, 2021 doi: 10.3791/62018
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1, 1,2, 4, 4, *1,2,5, *1,2
1Immune Regulation Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Infection Immunology Group, Institute of Medical Microbiology, Infection Prevention and Control, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 3Institute for Molecular and Clinical Immunology, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 4Cellular Proteome Research, Helmholtz Centre for Infection Research, 5Experimental Pneumology, University Hospital of Pneumology, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg
* These authors contributed equally

Summary

Descrevemos um protocolo para a conjugação química do modelo de ovalbumin de antígeno para um anticorpo específico do receptor de endocitose para o direcionamento de células dendríticas in vivo. O protocolo inclui a purificação do anticorpo, a conjugação química do antígeno, bem como a purificação do conjugado e a verificação de uma conjugação eficiente.

Abstract

A entrega de antígenos direcionados para células dendríticas de apresentação cruzada (DC) in vivo in vivo induz eficientemente as respostas celulares de efeito T e exibe uma abordagem valiosa no design da vacina. O antígeno é fornecido em DC através de anticorpos específicos para receptores de endocitose, como o DEC-205, que induz a captação, processamento e apresentação da classe I e II do MHC.

A conjugação eficiente e confiável do antígeno desejado para um anticorpo adequado é um passo crítico na segmentação dc e, entre outros fatores, depende do formato do antígeno. A conjugação química de proteína de comprimento total para anticorpos purificados é uma estratégia possível. No passado, estabelecemos com sucesso a inter-vinculação do modelo antigen ovalbumin (OVA) e um anticorpo IgG2a específico DEC-205 (αDEC-205) para estudos in vivo DC direcionados em camundongos. O primeiro passo do protocolo é a purificação do anticorpo do supernacante do NLDC (células dendríticas não linfoides)-145 hibrim por cromatografia de afinidade. O anticorpo purificado é ativado para conjugação química por sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] ciclohexano-1-carboxilato) enquanto ao mesmo tempo os grupos de sulfhydryl da proteína OVA são expostos através de incubação com TCEP-HCl (tris (tris (2 carboxyethyl). O excesso de TCEP-HCl e sulfo-SMCC são removidos e o antígeno é misturado com o anticorpo ativado para acoplamento durante a noite. O conjugado αDEC-205/OVA resultante é concentrado e liberado de OVA não vinculado. A conjugação bem sucedida de OVA para αDEC-205 é verificada pela análise de manchas ocidentais e ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA).

Usamos com sucesso αDEC-205/OVA quimicamente cruzado para induzir respostas de células T citotóxicas no fígado e comparar diferentes adjuvantes para seu potencial em induzir imunidade humoral e celular após o direcionamento vivo do DEC-205+ DC. Além disso, esses conjugados quimicamente acoplados a anticorpos/antígenos oferecem ferramentas valiosas para a indução eficiente das respostas vacinais aos antígenos tumorais e têm sido comprovadamente superiores às abordagens clássicas de imunização em relação à prevenção e terapia de vários tipos de tumores.

Introduction

As células dendríticas (DC) são atores centrais do sistema imunológico. Tratam-se de um grupo diversificado de células especializadas em apresentação de antígenos e sua principal função é fazer a ponte entre imunidade inata e adaptativa1,2. É importante ressaltar que a DC não só desempenha um papel importante em respostas eficientes e específicas dirigidas por patógenos, mas também está envolvida em muitos aspectos da imunidade antitumoral1,3.

Devido ao seu papel exclusivo na imunidade do hospedeiro, a DC entrou em foco como células-alvo paraa vacinação 4. Uma abordagem é direcionar antígenos para DC in vivo para induzir respostas imunes específicas de antígenos e, nos últimos anos, um grande número de estudos tem sido dedicado à definição de receptores adequados e estratégias de segmentação1,4. Um exemplo é o receptor de lectina tipo C DEC-205, que pode ser alvo de anticorpos específicos DEC-205 para induzir a endocitose. É importante ressaltar que o alvo DO DEC-205 na combinação com adjuvantes adequados tem sido mostrado para induzir eficientemente células CD4+ e CD8+ T de longa duração, bem como respostas de anticorpos, também contra antígenos tumorais3,5,6,7,8,9.

Há uma série de estudos que mostram que antígenos conjugados direcionados à DC são superiores ao antígeno não conjugadolivre 3,5,10,11,12. Isso torna a conjugação do antígeno para o respectivo DC visando moiety um passo central nas abordagens de segmentação dc. No caso do direcionamento dc via anticorpos ou fragmentos de anticorpos, os antígenos podem ser quimicamente ou geneticamente ligados e qualquer estratégia fornece suas próprias (des)vantagens1. Por um lado, em construções de anticorpos-antígenos geneticamente modificados há um controle sobre a dose de antígeno, bem como a localização proporcionando comparabilidade superior entre os lotes1. Ao mesmo tempo, no entanto, a conjugação química precisa de menos preparação e proporciona mais flexibilidade especialmente na tentativa de testar e comparar diferentes antígenos e/ou estratégias de vacinação em modelos experimentais e pré-clínicos.

Aqui, apresentamos um protocolo para a conjugação química eficiente e confiável de ovalbumin (OVA) como um antígeno de proteína modelo para um anticorpo IgG2a específico DEC-205 (αDEC-205) adequado para o direcionamento in vivo DC em camundongos. Primeiro, o αDEC-205 é purificado a partir de células hybridoma NLDC-14513. Para conjugação química, é utilizado o sulfosuccinimidil heterobifuncional 4-[N-maleimidomethyl] ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), que contém os grupos de ester e maleiminimide n-hidroxisuccinimide( N-hidroxisuccinimide), permitindo a conjugação covalente de moléculas de amina e sulfidry-constitucional. Especificamente, as aminas primárias do anticorpo inicialmente reagem com sulfo-SMCC e o αDEC-205 ativado por maleimida resultante, então reage com a proteína OVA contendo sulfidryl reduzida através do CLOP-HCl (Tris(2-carboxyethyl) cloridrato. O produto final é quimicamente conjugado αDEC-205/OVA (Figura 1). Além da conjugação química em si, nosso protocolo descreve a remoção do excesso de OVA do conjugado, bem como a verificação da conjugação bem sucedida através da análise de manchas ocidentais e um ensaio imunológico específico ligado à enzima. Nós empregamos com sucesso essa abordagem no passado para conjugar quimicamente OVA e outras proteínas ou peptídeos imunogênicos para αDEC-205. Demonstramos vinculação eficiente às células CD11c+ in vitro, bem como a eficiente indução da imunidade celular e humoral in vivo.

Certamente, há desvantagens para este método, como na comparabilidade lot-to-lot e na dosagem exata do antígeno dentro do conjugado final. No entanto, a conjugação química proporciona flexibilidade experimental na escolha do anticorpo e do antígeno proteico em comparação com construções geneticamente modificadas. Portanto, acreditamos que essa abordagem é especialmente valiosa na avaliação de diferentes antígenos para sua eficiência na segmentação dc em modelos pré-clínicos de camundongos, importante também no contexto de respostas imunes antitumorais específicas.

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Protocol

Todos os experimentos animais descritos foram aprovados pela agência do governo local (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; arquivo número 33.12-42502-04-10/0108) e foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais e institucionais.

1. Produção de αDEC-205 a partir da linha celular hybridoma NLDC-145

  1. Para a produção de anticorpos, descongele as células NLDC-145 que produzem αDEC-205 a 37 °C em banho-maria. Expanda as células a 37 °C e 5% de CO2. Dois 75 cm2 garrafas serão necessárias para proceder à produção de anticorpos. Os procedimentos de cultura celular devem ser realizados em um gabinete de segurança para garantir condições seguras de trabalho e evitar a contaminação das culturas.
    1. Resuspend 1 mL de células descongeladas (1 x 106 - 5 x 106 células/mL) em 9 mL de meio ISF-1 suplementado com 1% de penicilina/estreptomicina (pré-aquecido a 37 °C) em um frasco de cultura celular (25 cm2). Coloque o frasco horizontalmente em uma incubadora de cultura celular a 37 °C, 5% DE CO2.
    2. Cultura as células a 37 °C e 5% DE CO2, até 70% de confluência. Isso normalmente deve ser alcançado depois das 24 - 48 h.
    3. Uma vez que as células sejam 70% confluentes, transfira a suspensão completa da célula NLDC-145 (10 mL) para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL usando um controlador de pipeta com uma pipeta em uma faixa de volume de 1-10 mL. Pelota as células por centrifugação a 250 x g por 10 min a temperatura ambiente.
    4. Isf-1 pré-aquecido médio a 37 °C em banho-maria e resuspenque a pelota em 12 mL de meio ISF-1 suplementado com penicilina/estreptomicina de 1%. Transfira a suspensão celular resuspended em um frasco de cultura celular fresca (75 cm2).
    5. Cultura e expansão das células em meio ISF-1 suplementadas com penicilina/estreptomicina de 1% a 37 °C e 5% DE CO2,até 70% confluentes e 99% viáveis. Isso normalmente deve ser alcançado depois de 48 - 72 h.
    6. Divida as células para dois frascos de 75 cm2. Para fazer isso primeiro lave a cultura celular flask superfície inferior/cultura com a suspensão celular para remover todas as células NLDC-145 da superfície. Transfira 6 mL da suspensão celular NLDC-145 cada uma em uma das duas garrafas frescas de 75 cm2 e adicione o meio ISF-1 pré-aquecido complementado com penicilina/estreptomicina de 1% até 12 mL.
      NOTA: Não renove o meio de cultura celular, pois as células NLDC-145 terão condicionado ao meio. Transfira as células junto com seu meio e preencha a cultura até o volume desejado com meio fresco. Isso é crucial para a viabilidade e a produção máxima de anticorpos pelas células NLDC-145.
    7. Expanda as culturas celulares a 37 °C e 5% de CO2, até cerca de 70% de confluentes que geralmente é alcançado após 48 - 72 h.
    8. Uma vez que as células sejam 70% confluentes, transfira 10 mL da suspensão celular NLDC-145 expandida de cada uma das 75 cm2 garrafas em uma garrafa de rolo PETG (polietileno tereftalato glicol) (1.050 cm2). Para isso, lave a superfície de fundo/cultura do frasco de cultura da cultura da célula com a suspensão celular para remover todas as células da superfície usando um controlador de pipeta e uma pipeta de 10 mL.
    9. Adicione 140 mL de isf-1 médio suplementado com penicilina/estreptomicina de 1% (pré-aquecido a 37 °C) diretamente da garrafa média para cada um dos NLDC-145 contendo garrafas de rolo que as enchem até a marca de 150 mL.
      NOTA: Veja nota na etapa 1.1.6.
    10. Cultura as garrafas de rolo a 37 °C, 5% CO2 e 25 rodadas/min durante três dias.
    11. Adicione 150 mL de isf-1 médio suplementado com penicilina/estreptomicina de 1% (pré-aquecido a 37 °C) a cada um dos NLDC-145 contendo garrafas de rolo que as enchem até a marca de 300 mL.
    12. Cultura as garrafas de rolo agora contendo 300 mL cultura cada um a 37 °C, 5% CO2 e 25 rodadas/min por mais três dias.
    13. Adicione mais 100 mL de isf-1 médio suplementado com penicilina/estreptomicina de 1% (pré-aquecido a 37 °C) a cada um dos frascos de rolo NIDC-145 contendo, preenchendo-as até a marca de 400 mL.
    14. Cultura as garrafas de rolo agora contendo 400 mL cultura cada um a 37 °C, 5% CO2 e 25 rodadas/min por mais sete dias.
      NOTA: Durante esta semana, a cultura fica muito densa (até 95% de densidade) e a viabilidade diminui (até 50%), permitindo a liberação máxima de anticorpos.
  2. Para a purificação do αDEC-205 da cultura supernadant despeje a suspensão celular NLDC-145 (de ambas as garrafas de rolo) diretamente para garrafas de centrífugação autoclaved de 500 mL.
    NOTA: Deve ser coletado um volume total de 800 mL de cultura.
    1. Centrifugar a cultura por 30 min a 8.600 x g e 4 °C para remover células e detritos.
    2. Colete os supernantes, descartando as pelotas e agrupando os supernantes em uma garrafa de reagente estéril.
      NOTA: A purificação do αDEC-205 pode ser iniciada imediatamente (etapa 2.) ou o sobrenante pode ser armazenado a curto prazo a 4 °C.

2. Purificação do anticorpo αDEC-205 do supernatante celular NLDC-145

NOTA: A partir do supernanato celular NLDC-145, αDEC-205 é purificado usando uma coluna de proteína G Sepharose (reutilizável). As dimensões da coluna são 15 mm x 74 mm e 5 mL de proteína G Sepharose são embaladas por coluna.

  1. Para preparação e lavagem da coluna proteína G Sepharose, coloque um plugue de borracha hermético na abertura superior da coluna proteína G Sepharose. Puna o plugue de borracha com duas cânulas estéreis (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 mm).
    1. Conecte uma seringa de 10 mL a uma das duas cânulas e um tubo de silício flexível (aproximadamente 100 cm de comprimento, 2,5 - 3 mm de diâmetro) com um conector de tubulação à segunda cânula.
      NOTA: A construção da seringa/plugue de borracha é reutilizável e fornece um vácuo resultando em um fluxo contínuo do grande volume de cultura sobrenassivo à coluna proteína G Sepharose. Para este fim, puxe ligeiramente o êmbolo da seringa para garantir o fluxo contínuo de fluidos nas etapas seguintes.
    2. Lave a coluna com 50 mL de ácido acético glacial de 0,1 M (pH 2) para remover o anticorpo potencialmente remanescente de qualquer purificação de anticorpos anterior. Coloque a extremidade do tubo de silício no ácido acético glacial de 0,1 M (pH 2) garrafa de reagente preenchido. Como resultado do vácuo induzido, 50 mL do ácido acético glacial de 0,1 M (pH 2) passam pela coluna proteína G Sepharose.
      NOTA: 0,1 M ácido acético glacial (pH 2) deve ser armazenado em uma garrafa de reagente ou recém-preenchido em um béquer.
    3. Lave a coluna com salina tamponada com fosfato de 100-200 mL (PBS). Coloque a extremidade do tubo de silício em uma garrafa de reagente ou béquer preenchido PBS. Deixe que 100-200 mL PBS execute dropwise através da coluna proteína G Sepharose.
  2. Para purificação de anticorpos do supernanato NLDC-145, carregue 800 mL do supernatante NLDC-145 (obtido a partir da etapa 1.2.2.2.) na coluna. Coloque a extremidade do tubo de silício na garrafa de reagente recheada de supernascedor NLDC-145. Deixe que 800 mL NLDC-145 supernatant execute dropwise através da coluna.
    1. Lave a coluna com 500 mL de PBS. Coloque a ponta do tubo de silício em uma garrafa de reagente ou béquer preenchido PBS. Deixe que 500 mL PBS execute dropwise através da coluna.
    2. Para elução, utilize 20 tubos de 1,5 mL e pipeta 100 μL de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) em cada tubo de 1,5 mL. Remova o plugue de borracha da coluna e a pipeta 1 mL de 0,1 M de gliccina (pH 3) para a câmara superior da coluna proteína G Sepharose para elutar o anticorpo da coluna. Colecione o fluxo diretamente como elunato em um dos tubos preparados de 1,5 mL.
    3. Repita a etapa de elução (2.2.2.2.) para todos os 20 tubos (1,5 mL).
    4. Determine a densidade óptica de todas as frações de elução a 280 nm (OD280) utilizando um espectotúmetro para identificar as frações contendo anticorpos.
      NOTA: Use a primeira fração de elução em branco.
    5. Acumule todas as frações com um OD280 maior que 0,5 (aproximadamente 10 frações).
    6. Armazene a coluna proteína G Sepharose cheia com 20% de etanol a 4 °C.
  3. Dialisar as eluções agrupadas contra 1000 mL PBS (em um béquer de 2000 mL) a 4 °C durante a noite usando tubos de diálise com um corte de peso molecular (MWCO) de 12 a 14 kDa.
    1. Corte o tubo de diálise em pedaços de 20 cm. Ferva a tubulação de diálise em 500-800 mL de 10 mM EDTA (pH 7.5) por 30 min em um béquer usando uma placa quente para remover a contaminação. Descarte a solução EDTA de 10 mM (pH 7.5) e ferva o tubo de diálise em água desionizada por 10 minutos.
      NOTA: O tubo de diálise pode ser usado diretamente ou armazenado em azida de sódio de 0,01% (NaN3)/H2O a 4 °C até o próximo uso.
    2. Feche a parte inferior da tubulação de diálise com um fechamento apropriado de tubos de diálise/único, grampo articulado e pipeta cuidadosamente a elução de anticorpos na tubulação de diálise. Feche a parte superior da tubulação de diálise com um segundo grampo.
    3. Fixar o grampo superior da tubulação de diálise em um suporte flutuante, coloque-o junto com uma barra de agitação magnética no béquer cheio de PBS e coloque o béquer em um agitador magnético.
    4. Dialyze durante a noite agitando a 4 °C.
  4. Para aumentar a concentração de αDEC-205, carregue o dialise completo para um concentrador centrífuga com MWCO de 10 kDa. Abra um grampo da tubulação e pipeta cuidadosamente o dialise completo da tubulação de diálise no concentrador centrífugo (10 kDa MWCO).
    NOTA: Não toque na parte inferior do concentrador com a ponta da pipeta.
    1. Centrifugar por 30 min a 693 x g (2.000 rpm) e 4 °C.
    2. Carregue o concentrador centrífugo com 10 mL de PBS e centrífuga a 693 x g (2.000 rpm) e 4 °C até que o volume final da solução de anticorpos seja de 1-1,5 mL.
      NOTA: Se necessário, repita a etapa de centrifugação de 2.4.1. para ajustar à quantidade desejada.
    3. Utilizando um espectrofotômetro, determine a densidade óptica da solução concentrada αDEC-205 a 280 nm (OD280). Use PBS como em branco.
    4. Calcule a concentração de αDEC-205 usando a seguinte fórmula:
      concentração [mg/mL] = OD280/1.4.
    5. Filtre a solução αDEC-205 utilizando uma unidade de filtro de seringa de 0,22 μm.
      NOTA: A purificação do αDEC-205 do supernanato celular nldc-145 híbrido também pode ser alcançada por FPLC (cromatografia líquida de proteína rápida). O αDEC-205 purificado pode ser armazenado a 4 °C ou a -18 °C para armazenamento a longo prazo.

3. Conjugação química de OVA para αDEC-205

NOTA: É necessária uma razão de 0,5 mg de proteína OVA a 2,5 mgs αDEC-205 (1:5) para a conjugação química ideal. No entanto, essa proporção pode variar para outras proteínas e anticorpos e precisa ser otimizada para conjugados alternativos. A redução das ligações de dissulfeto da proteína OVA é realizada por meio da incubação com 30 mM TCEP-HCl, o que expõe os grupos de sulfidríl para conjugação química a αDEC-205 e 240 μl de TCEP-HCl são necessários na etapa 3.2. Ambas as etapas, redução induzida pelo TCEP de OVA (etapa 3.1.) e ativação sulfo-SMCC de αDEC-205 (etapa 3.2.), devem ser realizadas preferencialmente em paralelo.

  1. Prepare recentemente uma solução DE 125 mM TCEP-HCl (pH 7.0). Pesar a quantidade desejada de TCEP-HCl e dissolver o TCEP-HCl na base de 0,9 M Tris (pH 8.8). Use tiras indicadoras de pH para testar o pH da solução TCEP-HCl de 125 mM (que deve ser neutra) e ajustar o pH com base Tris (pH 8.8).
    1. Pipeta 200 μL solução de proteína OVA (contendo 0,5 mg OVA) em um tubo estéril de 1,5 mL. Adicione 240 μl 125 mM TCEP-HCl e 560 μL de água ultrapura estéril à proteína OVA usando uma pipeta a uma concentração final de 0,5 mg/mL proteína OVA e 30 mM TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
      NOTA: 2,5 mg OVA Endograde (liofilizado) é dissolvido em PBS de 1 mL resultando em uma solução OVA de 2,5 mg/mL.
    2. Incubar o OVA/TCEP-HCl resultante à temperatura ambiente por 1,5 h.
      NOTA: Não prolongue esta etapa de incubação.
  2. Para ativar αDEC-205 para conjugação, dissolva 2 mg de sulfo-SMCC em 100 μL de água ultrauso.
    NOTA: O Sulfo-SMCC é suscetível à hidrólise. Portanto, devem ser utilizadas quantidades maiores de sulfo-SMCC não resolvidas ou disponíveis.
    1. Diluir αDEC-205 em PBS de modo que 2,5 mgs estejam contidos em 900 μL.
    2. Misture 2,5 mgs de αDEC-205 (volume de 900 μL; obtido a partir da etapa 3.2.1.) e 100 μL de sulfo-SMCC (obtido a partir da etapa 3.2.) em um tubo de 1,5 mL, resultando em um volume total de 1 mL.
    3. Incubar a solução αDEC-205/sulfo-SMCC por 30 min a 37 °C e 550 rpm em um bloco de aquecimento.
  3. Após essas incubações, o excesso de sulfo-SMCC e TCEP-HCl são imediatamente removidos das soluções usando colunas de dessecação (MWCO 7 kDa; volume de coluna de 5 mL).
    1. Gire as colunas (MWCO 7 kDa) de fechamento inferior, solte a tampa e coloque a coluna em um tubo cônico de 15 mL.
    2. Centrifugar por 2 min a 1.000 x g em temperatura ambiente para remover o líquido.
    3. Coloque a coluna em um tubo fresco e remova a tampa. Carregue lentamente o anticorpo/sulfo-SMCC e o OVA/TCEP-HCl, respectivamente, para o centro do leito de resina compacta de uma coluna cada.
    4. Centrifugar por 2 min a 1.000 x g em temperatura ambiente.
    5. Descarte as colunas após o uso. As soluções que contêm anticorpos e OVA preparados para conjugação estão nos tubos.
    6. Misture imediatamente ambas as soluções por pipetagem para conjugação de αDEC-205 e OVA.
    7. Incubar a mistura αDEC-205 resultante e OVA durante a noite a 4°C.
  4. Após a conjugação, o OVA não vinculado em excesso é removido da solução e o acoplado αDEC-205/OVA está concentrado usando um concentrador de proteína centrífuga (MWCO 150 kDa).
    1. Pré-enxágue o concentrador de proteína centrífugas (MWCO 150 kDa) por tubos de 12 mL de PBS na coluna e centrifugação por 2 min a 2.000 x g à temperatura ambiente.
      NOTA: Se necessário, repita a etapa de centrifugação (3.4.1.) até que um volume de cerca de 5 mL tenha passado pela coluna.
    2. Antes de carregar o αDEC-205/OVA no concentrador de proteína centrífugas, salve uma amostra de 20 μL do αDEC-205/OVA não concentrado para análise de manchas ocidentais. Armazene esta alíquota a 4 °C até a análise.
    3. Carregue o αDEC-205/OVA no concentrador de proteína centrífugas por pipetação.
      NOTA: Evite qualquer contato com a cama da câmara superior do concentrador centrífuga.
    4. Encha o concentrador a 15 mL com PBS e centrífugue o concentrador por 5 min a 2.000 x g em temperatura ambiente.
    5. Salve uma amostra do fluxo -through (flow-through I) para análise de manchas ocidentais e descarte o fluxo restante.
    6. Encha o concentrador a 10 mL com PBS e centrífugue o concentrador por pelo menos 8 min a 2.000 x g em temperatura ambiente.
    7. Guarde uma amostra para o segundo fluxo -through (flow-through II) para análise de manchas ocidentais e descarte o fluxo restante.
    8. Uma vez alcançado o enriquecimento desejado (cerca de 1,5 mL da solução αDEC-205/OVA deve ser deixado na câmara superior) aspirar suavemente a amostra concentrada.
      NOTA: Se sobrou muito fluido na câmara superior, a centrifugação pode ser repetida, mas deve ser mantida o mais curta possível.
  5. Determine a concentração proteica do αDEC-205/OVA resultante usando um espectrofotômetro microvolume. Use PBS como em branco.
  6. Filtre o αDEC-205/OVA utilizando uma unidade de filtro de seringa de 0,22 μm.
    NOTA: Para análise posterior e experimentos in vivo, o αDEC-205/OVA pode ser armazenado a 4 °C ou -18 °C.

4. Verificação da conjugação química por mancha ocidental

NOTA: Para verificação da conjugação química bem sucedida, é realizada a análise de manchas ocidentais detectando ova (4.2) ou αDEC-205 (4.10). A detecção de OVA (4.2.) ou αDEC-205 (4.10.) deve ser realizada em paralelo. Um agitador de plataforma orbital deve ser usado preferencialmente para todas as etapas de incubação das membranas de manchas ocidentais para permitir a distribuição uniforme das respectivas soluções.

  1. Prepare os géis padrão de 10% de SDS (sulfato de dodecila de sódio) para SDS-PAGE (eletroforese de gel de poliacrilamida de sulfato de sódio).
  2. Prepare as amostras para SDS-PAGE para detectar OVA conjugado e não conjugado e executar eletroforese de gel.
    1. Diluir diferentes quantidades de αDEC-205/OVA acoplado (por exemplo, 200, 100 e 50 ng), de OVA puro (por exemplo, 80, 70, 60, 50, 40 e 30 ng), uma alíquota de αDEC-205 não conjugado (por exemplo, 100 e 50 ng), uma amostra de conjugado não concentrado αDEC-205/OVA a partir do passo 3.4.2. (por exemplo, 125 ng) e uma alíquota de fluxo I e II (etapas 3.4.5. e 3.4.7., respectivamente; opcional) em 4 x tampão de amostra SDS não redutor.
      NOTA: Diferentes concentrações de conjugados e proteínas são carregadas para garantir que tanto o OVA livre quanto o conjugado possam ser detectados na mesma mancha.
    2. Desnaturar as amostras a 65 °C por 10 min e 550 rpm em um bloco de aquecimento.
  3. Carregue as amostras e um padrão de proteína em um gel SDS e execute ODS-PAGE.
  4. Realize a mancha padrão das proteínas do gel SDS até uma membrana PVDF ativada por metanol (polivinylidene difluoreto) (75 min, 125 mA).
  5. Após a mancha, coloque a membrana em um prato apropriado e bloqueie a membrana ao tubo de 25 mL de 4% de shake de substituição de refeição/TBS-T (soro fisiológico tampão/0,1% Tween 20) bloqueando tampão no prato que contém a membrana.
    1. Incubar a membrana na solução de bloqueio por 60 min a temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
  6. Descarte a solução de bloqueio e manche a membrana com o anticorpo primário αOVA coelho em 2% de reposição de farinha em pó/tampão de anticorpos TBS-T (diluição 1:3.000) por tubos de 15 mL de solução de anticorpos primários para a membrana no prato.
    1. Incubar a membrana por 45 min em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C (use o agitador de plataforma).
  7. Descarte a solução de anticorpos e lave a membrana no prato (use o agitador de plataforma).
    1. Adicione 25 mL de TBS-T à membrana e incubar por 5 min. Descarte a solução.
    2. Adicione 25 mL de TBS-T/0,5 M NaCl à membrana e incubar por 5 min. Descarte a solução.
    3. Adicione 25 mL de TBS-T/0,5% Triton X-100 à membrana e incubar por 5 min. Descarte a solução.
    4. Adicione 25 mL de TBS-T à membrana e incubar por 5 min. Descarte a solução.
  8. Manche a membrana com o anticorpo secundário αrabbit-IgG-HRPO (rabanete de rabanete de cavalo) em 2% de reposição de farinha em pó/tampão de anticorpos TBS-T (diluição 1:2.000) por tubos 15 mL de solução de anticorpos secundários para a membrana no prato.
    1. Incubar a membrana por 45 min em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C (no agitador da plataforma).
  9. Lave a membrana novamente conforme descrito na etapa 4.7.1.- 4.7.4. usando o agitador de plataforma. Para esta membrana, continue com o passo 4.16. (as seguintes etapas 4.10.- 4.15. (detecção do αDEC-205) pode ser realizado paralelamente às etapas 4.2.- 4.9.).
  10. Prepare as amostras para a detecção do αDEC-205 para SDS-PAGE e execute a eletroforese do gel.
    1. Diluir diferentes quantidades de αDEC-205/OVA (por exemplo, 200, 100 e 50 ng), do αDEC-205 não conjugado (por exemplo, 250, 125, 62,5 ng), de OVA puro (por exemplo, 80 e 70 ng), uma amostra de αDEC-205/OVA não concentrado da etapa 3.4.2. (por exemplo, 125 ng) e uma alíquota de fluxo I e II (etapas 3.4.5. e 3.4.7., respectivamente; opcional) em 4 x tampão de amostra SDS não redutor.
    2. Desnaturar as amostras a 65 °C por 10 min e 550 rpm em um bloco de aquecimento.
  11. Carregue as amostras e um padrão de proteína em um gel SDS e execute eletroforese de gel.
  12. Realizar a mancha padrão das proteínas do gel SDS para uma membrana PVDF ativada de metanol (polivinylidene difluoreto) (75 min, 125 mA).
  13. Após a mancha, coloque a membrana em um prato apropriado e bloqueie a membrana ao tubo de 25 mL de tampão de bloqueio de 10% (leite em pó/TBS-T) no prato que contém a membrana.
    NOTA: As soluções de bloqueio diferem entre a detecção de αDEC-205 e o OVA (etapa 4.5.).
    1. Incubar a membrana na solução de bloqueio por 60 min em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C (usando o agitador de plataforma).
  14. Descarte a solução de bloqueio e manche a membrana com o anticorpo αrat-IgG(H+L)-HRPO em 5% de leite em pó/tampão de anticorpos TBS-T (diluição 1:5.000) por tubos de 15 mL de solução de anticorpos para a membrana no prato.
    NOTA: Os buffers de anticorpos diferem entre a detecção αDEC-205 e a detecção de OVA (etapas 4.6./ 4.8.).
    1. Incubar a membrana por 45 min à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C (usando o agitador de plataforma).
  15. Lave bem a membrana no prato, conforme descrito nas etapas 4.7.1.- 4.7.4. (use o agitador de plataforma).
  16. Use um reagente de detecção apropriado para desenvolver o sinal HRP e detectar a chemiluminescence em uma sala escura usando filme de raio-x ou através de um sistema de imagem.

5. Verificação da conjugação química por ELISA

  1. Realize ELISA para verificação posterior da conjugação química bem sucedida resultando em αDEC-205/OVA.
  2. Cubra uma placa ELISA apropriada de 96 poços com 100 μL/well de 3 ng/μL de coelho αOVA anticorpo em tampão de revestimento (0,1 M bicarbonato de sódio (NaHCO3) pH 9,6 diluído em H2O).
    1. Incubar a placa durante a noite a 4 °C.
  3. Após o revestimento, lave a placa três vezes com PBS, por exemplo, usando uma arruela ELISA.
  4. Bloqueie a placa pipetando 200 μL de tampão de bloqueio (10% FCS em PBS) em cada poço da placa e incubar a placa por 30 minutos à temperatura ambiente.
  5. Diluir em série αDEC-205/OVA (obtido a partir da etapa 3.6.) 1:2 no buffer de bloqueio (10% FCS em PBS) para obter diluições que variam de 6 μg/mL até 93,8 ng/mL αDEC-205/OVA e adicionar 100 μL/bem dessas quantidades decrescentes de αDEC-205/OVA aos poços.
    1. Incubar a placa por 1h em temperatura ambiente.
  6. Lave a placa três vezes com PBS, por exemplo, usando uma arruela ELISA.
  7. Adicione 100 μL do anticorpo αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO (diluído a 1:2.000 no buffer de bloqueio (10% FCS em PBS)) a cada poço da placa.
    1. Incubar por 1h à temperatura ambiente.
  8. Lave a placa três vezes usando PBS, por exemplo, usando uma arruela ELISA.
  9. Adicione 50 μL de hrpo-substrato aos poços. Ao observar uma reação de cor clara, pare a reação através da adição de 150 μl de solução de parada (1M H2SO4) por poço.
  10. Após 5 min, leia a absorção a 450 nm usando um leitor ELISA.

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Representative Results

A conjugação química da proteína αDEC-205 para o OVA usando este protocolo normalmente permitirá uma geração eficiente de αDEC-205/OVA para abordagens de segmentação in vivo DC. Existem diferentes estratégias para verificar a técnica em si e testar a funcionalidade do conjugado rendido. A análise da mancha ocidental e o ELISA são usados para verificar a conjugação bem sucedida e, ao mesmo tempo, detectar OVA potencialmente deixado livre(Figura 2). Estudos in vitro de ligação (Figura 3) e imunizações in vivo (Figura 4) confirmam a vinculação do conjugado ao DEC-205 e direcionamento de DC.

A análise paralela da mancha ocidental é utilizada para detectar tanto o OVA conjugado (Figura 2A) quanto o conjugado αDEC-205(Figura 2B). Especificamente, o sinal positivo para OVA ao nível do peso molecular do anticorpo na mancha confirma a associação de OVA e do anticorpo(Figura 2A). Além disso, a coloração para OVA na análise de manchas ocidentais permite a detecção de OVA livre de excesso potencialmente ainda presente ao lado do αDEC-205/OVA render na etapa 3.6., o que não é o caso da mancha mostrada(Figura 2A). Caso sejam detectadas grandes quantidades de OVA grátis, etapas 3.4.1. para 3.4.8. do protocolo deve ser repetido. Complementar à coloração para OVA (Figura 2A),a coloração para αDEC-205 na análise de manchas ocidentais verifica a conjugação bem sucedida através de um aumento do peso molecular entre "nu" αDEC-205 e o conjugado como mostrado na Figura 2B.

Ao lado da mancha ocidental, também uma ELISA específica permite a verificação da conjugação bem sucedida do αDEC-205 ao OVA. Em contraste com as análises de manchas ocidentais, no entanto, esta ELISA não permite a detecção de αDEC-205 ou OVA livre e não conjugado. Devido à configuração do ensaio(Figura 2C),um sinal positivo só é produzido se a conjugação for eficiente. A associação positiva entre o sinal detectado (absorção a 450 nm) e a quantidade analisada de proteína verifica a geração bem sucedida de αDEC-205/OVA por meio da conjugação química, conforme mostrado na Figura 2D. Ao mesmo tempo, o sinal positivo já rendeu a partir de 9,38 ng do conjugado αDEC-205/OVA demonstra a forte sensibilidade deste método(Figura 2D). Caso não haja aumento da adsorção para o aumento das quantidades do conjugado, a conjugação presumivelmente não foi bem sucedida. Neste caso, também as análises de manchas ocidentais produziriam resultados negativos, ou seja, sem detecção do conjugado na mancha manchada de OVA e sem aumento do peso molecular na mancha manchada para αDEC-205.

Enquanto os ensaios de mancha ocidental e ELISA são usados para avaliar a conjugação e a remoção de antígeno livre como tal, análises funcionais subsequentes são necessárias para confirmar a vinculação ao DEC-205 e a segmentação de DC. Para isso, realizamos estudos in vitro de vinculação (Figura 3) e imunizações in vivo (Figura 4). Para esses experimentos, as fêmeas C57BL/6 e 8-12 semanas de balb/c foram obtidas de fontes comerciais ou criadas na instalação animal do Centro helmholtz de pesquisa de infecções (HZI) e foram alojados sob condições específicas sem patógenos. A Figura 3 demonstra ensaios funcionais para a vinculação de um conjugado de αDEC-205 e da proteína do Núcleo HCV (αDEC-205/Core) a células CD11c+ in vitro. A citometria de fluxo mostrou claramente αDEC-205/Core para ligar eficientemente células CD11c+ derivadas da medula óssea(Figura 3A, B), bem como cd11c+ esplenócitos recém-isolados (dados não mostrados). Estes ensaios demonstram a conjugação química para não interferir na capacidade de ligação do αDEC-205. Isso também é confirmado por análises de imunofluorescência que mostram ligação de αDEC-205/Core ao MHC-II+ CD11c+ células classificadas a partir de células dendríticas derivadas de medula óssea in vitro (BMDC)(Figura 3C).

No passado, mostramos os conjugados αDEC-205/OVA produzidos pelo protocolo demonstrado para induzir eficientemente respostas imunes específicas do OVA in vivo em camundongos, confirmando a geração bem sucedida do conjugado, bem como a segmentação funcional de DC (Figura 4)12,14. Especificamente, a vacinação subcutânea com respostas imunes específicas de OVA αDEC-205/OVA induzidas eficientemente de forma eficiente e celular. É importante ressaltar que, em um modelo de desafio de adenovírus recombinante, detectamos células antivirais CD8+ T capazes de eliminar hepatócitos infectados por vírus, o que tem fortes implicações para vacinas direcionadas aos vírus hepatotrópicos12. Além disso, a indução altamente eficaz de células T citotóxica específicas de antígeno sublinha o potencial dessa abordagem para a in vivo priming da imunidade antitumoral. Além disso, utilizamos com sucesso o αDEC-205/OVA para testar e comparar diferentes adjuvantes no contexto do in vivo DC targeting14. Na vacinação com αDEC-205/OVA juntamente com a combinação adjuvante Poly(I:C) (ácido poliinosinico-policídílico) e CpG (oligodeoxynucleotot sintético os motivos de IG não metilados observaram geralmente(Figura 4A) e, por alguns pontos de tempo, níveis de IgG específicos do OVA em comparação com a vacinação apenas com OVA(Figura 4B). Além disso, o CD4+ cd4 específico do OVA induzido eficientemente αDEC-205/OVA induziu eficientemente as respostas de células CD8+ bem como as respostas de células CD8+ T(Figura 4C, D) e a resposta celular CD8 + T induzida por OVA excedeu significativamente a induzida apenas pelo OVA(Figura 4D).

Figure 1
Figura 1: Modelo da conjugação química de αDEC-205 e OVA. Em um primeiro passo, a amina primária do αDEC-205 reage com o éster NHS do sulfo-SMCC crosslinker resultando em maleimida ativada αDEC-205. Após a redução das ligações de dissulfeto da proteína OVA através da incubação com TCEP-HCl, o maleimídeo ativado αDEC-205 reage com a proteína OVA reduzida tcep-HCl para formar o conjugado anticorpo/anticorpo OVA αDEC-205/OVA. Abreviaturas: N-hydroxysuccinimide ester (éster NHS); sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]ciclohexane-1-carboxilato (sulfo-SMCC); Cloridrato de fosfina tris (2-carboxysethyl)fosfina (TCEP-HCl). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Verificação do αDEC-205/OVA quimicamente conjugado. Para verificar a conjugação química eficaz do αDEC-205 e da proteína OVA, são realizadas análises de manchas ocidentais(A,B) e ELISA(C,D). Amostras de αDEC-205/OVA, αDEC-205 e diferentes concentrações de proteína OVA foram submetidas a SDS-PAGE (10%) e análise subsequente de manchas ocidentais utilizando um anticorpo primário αOVA coelho e um anticorpo secundário αrabbit-IgG-HRPO para detectar proteína OVA (A) ou um anticorpo αrat-IgG(H+L)-HRPO para detectar αDEC-205 (B). (C) Representação esquemática do ELISA para verificação do conjugado αDEC-205/OVA. O anticorpo de revestimento αOVA do coelho liga αDEC-205/OVA através do OVA conjugado. O bode αrat-IgG(H+L)-HRPO reconhece a fração αDEC-205 do conjugado vinculado e um sinal positivo confirma assim a conjugação eficaz. (D) ELISA foi realizada conforme descrito em (C). Foram analisados os montantes diluídos em série (1:2) de αDEC-205/OVA (600 ng a 9,38 ng). Os dados são mostrados como a média dos triplicados de um ensaio representativo. Abreviaturas: ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA); peroxidase de rabanete de cavalo (HRPO); ovalbumina (OVA); sulfato de sulfato de sódio eletroforese de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Os painéis A e B foram modificados a partir de Volckmar et al.12. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Vinculação de αDEC-205/Núcleo às células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC) por microscopia de fluítometria e imunofluorescência. Para analisar a capacidade do αDEC-205/Core de vincular sua molécula-alvo DEC-205 em BMDCs in vitro,   foram realizadas análises de triagem celular ativada por fluorescência (FACS)(A,B)e microscopia de imunofluorescência(C). Resumindo, as células de medula óssea foram isoladas das patas traseiras de camundongos balb/c fêmeas (n=3) 8-12 semanas de idade e cultivadas em meio RPMI suplementada com penicilina/estreptomicina de 1%, 1% glutamina, 0,25 mM mercaptoetanol e 5 ng/mL GM-CSF (fator estimulante da colônia granulocyte-macrógea). No dia 6, os BMDCs não aderentes foram cuidadosamente colhidos e utilizados para análises vinculativas. (A,B) Os BMDCs gerados in vitro foram incubados com 10 μg/mL αDEC-205/Core, αDEC-205 ou médio (controle) por 1 h a 4 °C seguido de coloração com αCD11c (clone HL3) com a etiqueta APC. A detecção do αDEC-205/Core ligado na superfície dos BMDCs foi realizada por manchas adicionais das células com a cabra αrat(A)ou o núcleo do mouse αHCV [clone C7-50] seguido de coloração αmouse-IgG1-PE secundária(B). Histogramas representativos mostram o sinal pe e % células PE positivas das células CD11c+ fechadas. (C) Os BMDCs gerados in vitro a partir de camundongos ingênuos Balb/c foram classificados para células MHC-II+ e CD11c+ e foram incubados com 10 μg/mL αDEC-205/Core por 1 h a 4 °C. O αDEC-205/Core ligado à célula foi manchado com Alexa 594-acoplado αrat-IgG ou com mouse αHCV Core [clone C7-50] e Alexa 488-acoplado αmouse-IgG por 30 min a 4 °C após a lavagem. As células foram visualizadas por microscopia de imunofluorescência (barra de escala = 20 μm). A capacidade de vinculação de αDEC-205/Core aos BMDCs foi confirmada por uma sobreposição de ambas as manchas (duplo positivo = laranja). Abreviaturas: células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC); classificação celular ativada por fluorescência (FACS); fator estimulante da colônia granulocito-macrófago (GM-CSF); vírus da hepatite C (HCV). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Respostas imunes humorais e celulares específicas do OVA após a imunização com αDEC-205/OVA. A funcionalidade do αDEC-205/OVA para atingir a DC in vivo foi comprovada por meio de experimentos de imunização, conforme publicado anteriormente na Volckmar et al.12. Resumidamente, camundongos C57BL/6 fêmeas de 6-8 semanas (n=5) foram subcutâneamente imunizados no dia 0, 14 e 28 com 30 μg αDEC-205/OVA conjugados juntamente com os adjuvantes 50 μg Poly(I:C)/50 μg CpG, 30 μg αDEC-205 sozinho ou 7 μg proteína OVA sozinho em um volume total de 50 μL PBS por animal. Outros controles foram tratados apenas com a PBS. (A,B) Para monitorar a resposta imune humoral, os camundongos vacinados foram levemente anestesiados através da inalação de isoflurano e amostras de sangue foram coletadas do seio retro-orbital nos dias 0, 13 e 27 e por punção cardíaca no dia 42. Sera foram preparados como descrito e testado para a presença de IgG específico do OVA pela ELISA12. Os títulos de ponto final foram expressos como o valor recíproco da última diluição do soro que rendeu uma absorção duas vezes acima dos valores dos controles negativos. Os resultados são compilados a partir de três experimentos independentes. (A) Cinética dos títulos de soro total de soro específico de OVA mostrados como a média do grupo. (B) Ova-específico IgG titer no dia 27 e dia 42 mostrado para ratos individuais juntamente com a média do grupo. Estatísticas: teste t de dois lados não pago. (C,D) A indução das respostas imunes celulares foi analisada por ensaios de ponto imunossorbente ligado à enzima (ELISPOT) utilizando o kit de detecção murine IFNγ no dia 42, conforme publicado anteriormente12. Esplenócitos isolados de camundongos imunizados foram agrupados para os grupos experimentais e o número de unidades de formação de manchas IFNγ/106 células após estimulação com 5 mg/mL CD4+ (C) ou CD8+ Peptídeo OVA(D) foi analisado (Peptídeos OVA: CD4323-339 (ISQAVHAAHAHAHANEAGR) e CD8257-264 (SIINFEKL)). As barras representam a média ± SEM (n=5, triplicados a partir de amostras agrupadas). Estatísticas: ANOVA unidirecional com o teste de comparações múltiplas de Dunnett (**p<0,01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Abreviaturas: sequências de oligonucleotídeos citosine-fosfato-guanina (CpG), ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA), ponto imunossorbente ligado à enzima (ELISPOT), oval Aconófila (OVA), soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS), ácido policídico-policídico poliinosinico (Poly(I:C)http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A conjugação química de um anticorpo específico do receptor de endocitose e um antígeno proteico fornece uma abordagem eficiente e, importante, também flexível para o direcionamento in vivo DC em modelos pré-clínicos de camundongos. Com nosso protocolo, fornecemos uma abordagem eficiente para a conjugação bem sucedida do modelo de antígeno OVA a um anticorpo IgG específico DEC-205.

Em nosso protocolo, αDEC-205 é purificado de uma célula híbrida e, no passado, purificamos o anticorpo usando proteína G sepharose como descrito. Note-se que também usamos o FPLC para purificar o αDEC-205 em estudos posteriores e a conjugação química subsequente também foi eficiente. Os passos críticos para uma conjugação química eficiente são o escoramento do anticorpo e da proteína. Otimizamos essas etapas de diferentes protocolos disponíveis para finalmente realizar a incubação do anticorpo com o sulfo-SMCC crosslinker e redução da proteína através do TCEP-HCl. Especificamente, neste ponto as etapas críticas são a nova preparação do TCEP-HCl (etapa 3.1.) e a duração da incubação do TCEP-HCl com a proteína, que não deve ser estendida (etapa 3.1.2.). Além disso, o tampão proteico utilizado para a redução das ligações de dissulfeto através do TCEP-HCl é crítico, pois pode afetar negativamente a redução pelo TCEP-HCl. Além disso, é importante misturar imediatamente o anticorpo ativado e a proteína reduzida (etapa 3.3.6.) para garantir condições ideais de reação para a conjugação. Em nossas mãos, essa abordagem produziu os resultados mais eficientes e confiáveis em relação à conjugação. Outro passo crítico para abordagens in vivo subsequentes é a remoção do OVA desvinculado do conjugado αDEC-205/OVA. Para verificar esta etapa, otimizamos as análises de manchas ocidentais e recomendamos a detecção tanto do αDEC-205 conjugado quanto da proteína OVA conjugada(Figura 2A e B). Caso o OVA não vinculado esteja presente na solução conjugada final, a mancha e a detecção de concentrações conhecidas de OVA (como na Figura 2A) ajudarão a estimar a quantidade de OVA não vinculado em relação à quantidade total de proteína carregada para o SDS-PAGE. Se a conjugação foi ineficiente, a solução de problemas deve abordar a relação antígeno/anticorpo utilizado para a conjugação. Caso a conjugação tenha sido eficaz conforme detectado pela ELISA, mas não pode ser detectada pela análise de manchas ocidentais, temos experimentado as concentrações de anticorpos nas análises de manchas ocidentais (etapas 4.6., 4.8., 4.14.) o fator mais crítico.

A principal limitação de nossa abordagem é uma eficiência conjugal às vezes variada em que não há correlação fixa entre o número de moléculas de anticorpos e a quantidade de proteína acoplada. No entanto, acreditamos e experimentamos que o protocolo demonstrado permite de forma confiável estudos in vivo subsequentes de dc direcionados que produzem resultados reprodutíveis. Além disso, enquanto em princípio, em nosso protocolo tanto o αDEC-205 quanto a proteína OVA podem ser trocados por anticorpos e antígenos alternativos para estudos in vivo de diversos interesses, etapas individuais da conjugação química precisarão ser recentemente otimizadas para os novos componentes. Isso se aplica principalmente à relação anticorpo/antígeno ideal e pode depender, por exemplo, da acessibilidade de resíduos de Cys redutíveis. Em nossas abordagens, as razões ideais que resultaram em reações conjugais bem sucedidas foram 1:5 para OVA para αDEC-205 e 1,35:1 para as proteínas HCV NS3 (proteína não estrutural 3) e Núcleo para αDEC-205. Para cada conjugado, os efeitos negativos do crosslinker ou a conjugação como tal sobre a capacidade de ligação de antígeno do anticorpo precisam ser excluídos. Note-se que a conjugação de peptídeos imunogênicos em vez de proteínas de comprimento integral é menos problemática a esse respeito. No entanto, as proteínas proporcionam maior diversidade de antígenos na posterior imunização. As abordagens de fusão genética apresentam uma alternativa à conjugação química e também têm claras vantagens1. Em última análise, a escolha da estratégia de vincular anticorpos e antígenos para a segmentação de DC dependerá de recursos, foco de pesquisa e aplicações antecipadas dos conjugados. Acreditamos que a flexibilidade relativa em relação a anticorpos e antígenos apresenta uma grande vantagem da conjugação química e, de fato, utilizamos o protocolo descrito aqui para a conjugação química eficiente do αDEC-205 para diferentes proteínas do vírus da hepatite C (HCV) (Figura 3 e dados não mostrados).

No geral, acreditamos que a conjugação química de anticorpos específicos do receptor de endocitose para antígenos proteicos, como em αDEC-205/OVA, exibe uma ferramenta flexível e confiável para gerar conjugados anticorpos/anticorpos de valor excepcional no estudo de abordagens de direcionamento dc, incluindo também aqueles que visam induzir imunidade antitumor, especialmente em modelos animais pré-clínicos.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores agradecem a S. Prettin pela assistência técnica especializada. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Associação Helmholtz de Centros de Pesquisa Alemães (HGF) que foi fornecida como parte da "Imunoterapia dos Cânceres" da Aliança Helmholtz (HCC_WP2b).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
antibody buffer 2 % 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
antibody buffer 5 % 5 % milk powder (w/v) in TBS-T
blocking buffer (ELISA) 10 % FBS in PBS
blocking buffer 4 % 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
blocking buffer 10 % 10 % milk powder (w/v) in TBS-T
cell culture flask T25 Greiner Bio-One 690175 we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )
cell culture flask T75 Greiner Bio-One 658175 we use standard CELLSTAR  filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) 
cell culture flask T175 Greiner Bio-One 661175 we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)
centrifugal concentrator MWCO 10 kDa Sartorius VS2001 Vivaspin 20 centrifugal concentrator
centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml Thermo Fisher Scientific 88532 Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available 
centrifuge bottles Nalgene 525-2314 PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany
coating buffer (ELISA) 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)
desalting columns MWCO 7 kDa Thermo Fisher Scientific 89891 Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL
detection reagent ELISA (HRPO substrate) Sigma-Aldrich/Merck T8665-100ML 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system
detection reagent western blot (HRPO substrate) Roche/Merck 12 015 200 01 Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)
dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa SERVA Electrophoresis 44110 Visking dialysis tubing, 16 mm diameter
ELISA 96-well plate Thermo Fisher Scientific 442404 MaxiSorp Nunc-Immuno Plate
fetal calf serum PAN-BIOtech P40-47500 FBS Good forte
ISF-1 medium Biochrom/bioswisstec F 9061-01
milk powder Carl Roth T145.2 powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket
NLDC-145 hybridoma ATCC HB-290 if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC
non-reducing SDS sample buffer 4 x  for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue
ovalbumin Hyglos (via BioVendor) 321000 EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used
PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles Nunc In Vitro 734-2394 standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany  
pH indicator strips Merck 109535 pH indicator strips 0-14
polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) Jackson ImmunoResearch  112-035-062 obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot
polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody  (ELISA) Jackson ImmunoResearch  112-035-068 obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA
polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) Jackson ImmunoResearch  111-035-045  obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot
polyclonal rabbit αOVA (ELISA) Abcam ab181688 used at 3 ng/µl
polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) OriGene R1101 used at 1:3,000 for western blot
Protein G Sepharose column Merck/Millipore P3296 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
protein standard Thermo Fisher Scientific 26616 PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa
PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane Merck/Millipore IPVH00010 immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane
rubber plug Omnilab 5230217 DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm)
silicone tube Omnilab 5430925 DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm)
Slim-Fast we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder
stopping solution (ELISA) 1M H2SO4
sulfo-SMCC Thermo Fisher Scientific 22322 Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)
syringe filter unit 0.22 µm  Merck/Millipore SLGV033RS Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized 
syringe 10 ml Omnilab Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun
Sterican® cannulas B. Braun Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow
TBS-T Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20
TCEP-HCl Thermo Fisher Scientific A35349
tubing connector Omnilab Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube

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References

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Pesquisa do Câncer Questão 168 direcionamento de células dendríticas células dendríticas DEC-205 entrega de antígeno conjugação de antígeno conjugação química endocitose mediada por anticorpos vacinação imunidade antitumoral
Conjugação Química de um anticorpo purificado DEC-205-Directed com proteína de comprimento completo para direcionar células dendríticas de camundongos <em>in vitro</em> e <em>in vivo</em>
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Volckmar, J., Knop, L., Hirsch, T.,… More

Volckmar, J., Knop, L., Hirsch, T., Frentzel, S., Erck, C., van Ham, M., Stegemann-Koniszewski, S., Bruder, D. Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (168), e62018, doi:10.3791/62018 (2021).

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