免疫蛍光を使用して、ゼブラフィッシュ胚の心臓におけるPM2.5誘導DNA損傷を検出する
Summary
このプロトコルは、免疫蛍光アッセイを使用して、ゼブラフィッシュ胚の解剖された心臓におけるPM2.5誘発DNA損傷を検出する。
Abstract
周囲の微小粒子状物質(PM2.5)曝露は心臓発達毒性を引き起こす可能性があるが、基礎となる分子メカニズムはまだ不明である。8-ヒドロキシ-2’デオキシゲナーゼ(8-OHdG)は、酸化的DNA損傷のマーカーであり、γH2AXはDNA二重鎖切断のための感受性マーカーである。本研究では、免疫蛍光アッセイを用いてゼブラフィッシュ胚の心臓部におけるPM2.5誘導8-OHdGおよびγH2AXの変化を検出することを目的とした。ゼブラフィッシュ胚は、受精後2時間(hpf)で抗酸化N-アセチルL-システイン(NAC,0.25 μM)の有無に関して、PM2.5 から5μg/mLで抽出可能な有機物質(EOM)で処理した。DMSOは車両制御として使用されました。72hpfでは、注射針を使用して胚から心臓を解剖し、固定して透過させた。ブロックされた後、サンプルを8-OHdGおよびγH2AXに対する一次抗体でプローブした。次いで、試料を洗浄し、二次抗体でインキュベートした。得られた画像を蛍光顕微鏡観察下で観察し、ImageJを用いて定量した。結果は、PM2.5 からのEOMがゼブラフィッシュ胚の心臓部で8-OHdGおよびγH2AX信号を有意に増強したことを示す。しかしながら、NACは、活性酸素種(ROS)スカベンジャーとして作用し、EOM誘導DNA損傷を部分的に打ち消した。ここでは、ゼブラフィッシュ胚の心臓における環境化学的誘導タンパク質発現変化の検出に適用できるPM2.5-誘発心臓欠陥におけるDNA損傷の役割を調べるための免疫蛍光プロトコルを提示する。
Introduction
大気汚染は今や世界が直面している深刻な環境問題です。大気質の最も重要な指標の一つである周囲微小粒子状物質(PM2.5)は、多数の有害物質を運び、血液循環系に入り、人間の健康に深刻な害を及ぼす可能性がある。疫学研究は、PM2.5曝露が先天性心不全(CHD)2、3のリスクの増加につながることを実証した。また、動物実験の証拠は、PM2.5がゼブラフィッシュの胚およびマウスの子孫に異常な心臓発達を引き起こす可能性があることを示したが、PM2.5の心臓発達毒性の分子機構は依然としてほとんど知られていない4、5、6である。
DNA損傷は、細胞周期停止を引き起こし、アポトーシスを誘発し、前駆細胞の可能性を広範囲に破壊し、その結果、心臓の発達を損なう可能性がある7)。PM2.5を含む環境汚染物質は、酸化ストレス機構8,9を通じてDNAを攻撃する可能性を有することが十分に文書化されている。ヒトとゼブラフィッシュの心臓の発達は、酸化ストレス10、11、12に敏感です。8-OHdGは酸化的DNA損傷マーカーであり、γH2AXシグナルはDNA二重鎖切断のマーカーである。細胞内システインとグルタチオンの合成前駆体であるN-アセチル-L-システイン(NAC)は、抗酸化化合物として広く使用されています。本研究では、NACを用い、PM2.5-誘導DNA損傷13における酸化ストレスの役割を調べる。
脊椎動物のモデルとしてのゼブラフィッシュは、脊椎動物14,15の間で心臓開発のメカニズムが高度に保存されているため、心臓の発達やヒト心血管疾患の研究に広く用いられている。ゼブラフィッシュをモデルとして使用する利点には、小型、強力な生殖能力、低給餌コストなどがあります。これらの研究に特に興味深いのは、ゼブラフィッシュ胚は初期の発達の間に循環系に依存せず、重度の心臓奇形14を生き残ることができる。さらに、その透明性により、全身を顕微鏡下で直接観察することができます。このように、ゼブラフィッシュ胚は、種々の環境化学物質への曝露の結果として心臓発達毒性の誘導に関与する分子機構を評価する優れた機会を提供する5、16、17。我々は以前にPM2.5誘導酸化ストレスがDNA損傷およびアポトーシスをもたらし、ゼブラフィッシュ18の心臓奇形をもたらすことを報告した。本研究では、ゼブラフィッシュ胚の心臓部におけるPM2.5誘導DNA損傷を調査するための詳細なプロトコルを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゼブラフィッシュは、環境化学物質の心臓発達毒性を研究するための優れた脊椎動物モデルであるが、胚心臓の小さいサイズに起因して、ウェスタンブロット分析のための十分なタンパク質を得ることは困難である。そこで、PM2.5に曝露したゼブラフィッシュ胚の心臓におけるDNA損傷バイオマーカーのタンパク質発現レベルを定量化するための高感度免疫蛍光法を提示する。
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国立自然科学財団(助成金番号:81870239、81741005、81972999)と江蘇高等教育機関の優先学術プログラム開発によって支援されました。
Materials
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
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