Summary

Zebra Balığı Embriyo Kalplerinde PM2.5kaynaklı DNA Hasarını Tespit Etmek için İmmünofluoresans Kullanma

Published: February 15, 2021
doi:

Summary

Bu protokol, zebra balığı embriyolarının parçalanmış kalplerinde PM2.5kaynaklı DNA hasarını tespit etmek için bir immünofluoresans testi kullanır.

Abstract

Ortam ince partikül madde (PM2.5)maruziyeti kardiyak gelişimsel toksisiteye yol açabilir, ancak altta yatan moleküler mekanizmalar hala belirsizdir. 8-hidroksi-2’deoksijenaz (8-OHdG) oksidatif DNA hasarının bir belirtecidir ve φH2AX DNA çift iplikçik kırılmaları için hassas bir belirteçtir. Bu çalışmada zebra balığı embriyolarının kalbindeki PM2.5kaynaklı 8-OHdG ve φH2AX değişikliklerinin immünofluoresans tahlilini kullanarak tespit edilmesi amaçlanmıştır. Zebra balığı embriyoları,2 saat sonra döllenme (hpf) sırasında antioksidan N-asetil-L-sistein (NAC, 0.25 μM) varlığında veya yokluğunda PM 2.5’ten 5 μg/mL’de çıkarılabilir organik konularla (EOM) tedavi edildi. DMSO araç kontrolü olarak kullanıldı. 72 hpf’de kalpler şırınga iğnesi kullanılarak embriyolardan parçalandı ve sabitlendi ve permeabilize edildi. Bloke edildikten sonra, örnekler 8-OHdG ve φH2AX’a karşı primer antikorlarla araştırıldı. Numuneler daha sonra ikincil antikorlarla yıkandı ve inkübe edildi. Elde edilen görüntüler floresan mikroskopisi altında gözlemlendi ve ImageJ kullanılarak ölçülmedi. Sonuçlar, PM2.5’ten EOM’nin zebra balığı embriyolarının kalbinde 8-OHdG ve φH2AX sinyallerini önemli ölçüde artırdığını göstermektedir. Bununla birlikte, reaktif bir oksijen türü (ROS) çöpçü olarak hareket eden NAC, EOM kaynaklı DNA hasarına kısmen karşı koydu. Burada, zebra balığı embriyolarının kalplerindeki çevresel kimyasal kaynaklı protein ekspresyon değişikliklerinin tespitine uygulanabilecek PM2.5kaynaklı kalp kusurlarında DNA hasarının rolünü araştırmak için bir immünofluoresans protokolü sunuyoruz.

Introduction

Hava kirliliği artık dünyanın karşı karşıya olduğu ciddi bir çevre sorunudur. Hava kalitesinin en önemli göstergelerinden biri olan ortam ince partikül maddesi (PM2.5),çok sayıda zararlı madde taşıyabilir ve kan dolaşım sistemine girerek insan sağlığına ciddi zararlar verebilir1. Epidemiyoloji çalışmaları PM2.5 maruziyetinin doğumsal kalp kusurları (CHD)2,3riskinin artmasına yol açabileceğini göstermiştir. Hayvan deneylerinden elde edilen kanıtlar, PM2.5’in zebra balığı embriyolarında ve farelerin yavrularında anormal kardiyak gelişime neden olabileceğini göstermiştir, ancak PM2.5’in kardiyak gelişimsel toksisitesinin moleküler mekanizmaları hala büyük ölçüde bilinmemektedir4,5,6.

DNA hasarı hücre döngüsünün tutuklanmasına neden olabilir ve apoptoza neden olabilir, bu da progenitör hücrelerin potansiyelini büyük ölçüde yok edebilir ve sonuç olarak kalp gelişimini bozabilir7). PM2.5de dahil olmak üzere çevresel kirleticilerinoksidatifstres mekanizmaları 8,9aracılığıyla DNA’ya saldırma potansiyeline sahip olduğu iyi belgelenmiştir. Hem insan hem de zebra balığı kardiyak gelişimi oksidatif strese karşı hassastır10,11,12. 8-OHdG oksidatif bir DNA hasar belirtecidir ve φH2AX sinyali DNA çift iplikçik kırılmalarının bir işaretidir. Hücre içi sistein ve glutatyonun sentetik öncüsü olan N-asetil-L-sistein (NAC), yaygın olarak anti-oksidatif bileşik olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada, PM2.5’teoksidatif stresin rolünü araştırmak için NAC kullanıyoruz – indüklenmiş DNA hasarı13.

Zebra balığı bir model omurgalı olarak kardiyak gelişimi ve insan kardiyovasküler hastalıklarını incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır, çünkü kardiyak gelişim mekanizmaları omurgalılar arasında yüksek oranda korunmaktadır14,15. Zebra balıklarını model olarak kullanmanın avantajları arasında küçük boyutları, güçlü üreme yetenekleri ve düşük beslenme maliyeti bulunur. Bu çalışmaların özellikle ilgisini çeken zebra balığı embriyoları erken gelişim sırasında dolaşım sistemine bağlı değildir ve şiddetli kalp malformasyonunda hayatta kalabilir14. Ayrıca, saydamlıkları tüm vücudun doğrudan mikroskop altında gözlemlenmesine izin verir. Bu nedenle, zebra balığı embriyoları, çeşitli çevresel kimyasallara maruz kalmanın bir sonucu olarak kardiyak gelişimsel toksisitenin indüksiyonunda yer alan moleküler mekanizmaları değerlendirmek için olağanüstü bir fırsat sağlar5,16,17. Daha önce PM2.5kaynaklı oksidatif stresin DNA hasarına ve apoptoza yol açtığını ve zebra balıklarında kalp malformasyonlarına neden olduğunu bildirmiştik18. Bu çalışmada zebra balığı embriyolarının kalbinde pm2.5kaynaklı DNA hasarının araştırılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Protocol

Bu çalışmada kullanılan yabani tip zebra balığı (AB), Çin’in Wuhan kentindeki Ulusal Zebra Balığı Kaynak Merkezi’nden elde edilmiştir. Burada özetlenen tüm hayvan prosedürleri Soochow Üniversitesi Etik Kurulu Hayvan Bakım Kurumu tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır. 1. PM2.5 örnekleme ve organik bileşik ekstraksiyon NOT: PM2.5, daha önce açıklandığı gibi 1-7 Ağustos 2015 tarihleri arasında Suzhou, Çin’de kentsel…

Representative Results

Bu immünoresans tahlili, çevresel kimyasallara maruz kalan zebra balığı embriyolarının kalplerindeki protein ekspresyon değişikliklerini ölçmek için hassas ve spesifik bir yöntemdir. Bu temsili analizde, antioksidan NAC’nin yokluğunda veya varlığında PM2.5’e maruz kalan embriyolar kalp malformasyonlarının varlığı açısından değerlendirildi (Şekil 1). Gözlendiği…

Discussion

Zebra balığı, embriyo kalbinin küçük boyutu nedeniyle çevresel kimyasalların kardiyak gelişimsel toksisitesini incelemek için mükemmel bir omurgalı modeli olmasına rağmen, batı leke analizi için yeterli protein elde etmek zordur. Bu nedenle, PM2.5’emaruz kalan zebra balığı embriyolarının kalplerindeki DNA hasarı biyobelirteçlerinin protein ekspresyon seviyelerini ölçmek için hassas bir immünofluoresans yöntemi sunuyoruz.

Diseksiyon sırasında kalbin büt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe numarası: 81870239, 81741005, 81972999) ve Jiangsu Yükseköğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirilmesi tarafından desteklendi.

Materials

8-OHdG Antibody Santa Cruz Biotechnology, USA sc-66036 Primary antibody
Analytical balance Sartorius,China BSA124S
BSA Solarbio,Beijing,China SW3015 For blocking
DAPI Abcam, USA ab104139 For nuclear counterstain.
DMSO Solarbio,Beijing,China D8371
Fluorescence microscope Olympus, Japan IX73 For imaging fluorescence signals/
Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 Carlsbad,USA CW0159 Secondary antibody
Goat Anti-Rabbit IgG FITC Carlsbad,USA RS0003 Secondary antibody
N-Acetyl-L-cysteine(NAC) Adamas-Beta, Shanghai, China 616-91-1
Orbital shaker QILINBEIER,China TS-1
Paraformaldehyde Sigma,China P6148 Make 4% paraformaldehyde for fixation.
Phosphate Buffered Saline HyClone,USA SH30256.01 Prepare 0.1% Tween in PBS for washing.
PM2.5 sampler TianHong,Wuhan, China TH-150C For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling.
Re-circulating aquaculture system HaiSheng,Shanghai,China The zebrafish was maintained in it.
Soxhlet extractor ZhengQiao,Shanghai, China BSXT-02 For organic components extraction.
Stereomicroscope Nikon,Canada SMZ645 For heart dissection from zebrafish embryos.
Tricaine methanesulfonate (MS222) Sigma,China E10521 To anesthetize zebrafish embryos
Tween 20 Sigma,China P1379
γH2AX Antibody Abcam, USA ab26350 Primary antibody

References

  1. Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
  2. Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
  3. Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
  4. Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
  5. Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
  6. Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
  7. Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d’Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
  8. Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
  9. Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
  10. Yamashita, M. Apoptosis in zebrafish development. Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).
  11. Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
  12. Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
  13. Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
  14. Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
  15. Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
  16. Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
  17. Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
  18. van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
  19. Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
  20. Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
  21. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  22. Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).

Play Video

Cite This Article
Huang, Y., Tao, Y., Cai, C., Chen, J., Ji, C., Aniagu, S., Jiang, Y., Chen, T. Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts. J. Vis. Exp. (168), e62021, doi:10.3791/62021 (2021).

View Video