Пошаговое руководство по электроантенографии комаров
Summary
В настоящей статье подробно описан пошаговый протокол успешных и малошумных электроантэннограмм у нескольких родов комаров, включая как самок, так и самцов.
Abstract
Самки комаров являются самыми смертоносными животными на земле, ежегодно унося жизни более 1 миллиона человек из-за патогенов, которые они передают при приобретении кровяной муки. Чтобы найти хозяина для питания, комары полагаются на широкий спектр сенсорных сигналов, включая визуальные, механические, тепловые и обонятельные. В исследовании подробно описывается метод, электроантеннография (EAG), который позволяет исследователям оценить, могут ли комары обнаруживать отдельные химические вещества и смеси химических веществ в зависимости от концентрации. В сочетании с газовой хроматографией (ГХ-ЭАГ) этот метод позволяет подвергать антенны воздействию полной смеси свободного пространства / сложного пространства и определяет, какие химические вещества, присутствующие в интересующем образце, комар может обнаружить. Это применимо к запахам тела хозяина, а также к цветочным букетам растений или другим экологически значимым запахам (например, одорантам для мест яйцекладки). Здесь мы описали протокол, который допускает длительные сроки реакции на приготовление и применим как к самкам, так и к самцам комаров из нескольких родов, включая комаров Aedes, Culex, Anopheles и Toxorhynchitis . Поскольку обоняние играет важную роль во взаимодействии комаров и хозяев и в биологии комаров в целом, ЕАГ и ГХ-ЕАГ могут выявлять соединения, представляющие интерес для разработки новых стратегий борьбы с переносчиками болезней (например, приманки). В дополнение к поведенческим анализам можно определить валентность (например, аттрактанта, репеллента) каждого химического вещества.
Introduction
Комары являются самыми смертоносными организмами на Земле, унося жизни более миллиона человек в год и подвергая более половины населения мира риску воздействия патогенов, которые они передают, при укусах1. Эти насекомые полагаются на широкий спектр сигналов (т. е. тепловых, визуальных, механических, обонятельных, слуховых), чтобы найти хозяина, которым можно питаться (как растение, так и животное), для спаривания и яйцекладки, а также избегать хищников как на личиночной, так и на взрослой стадиях 2,3. Среди этих чувств обоняние играет решающую роль в вышеупомянутом поведении, в частности, для обнаружения молекул одоранта на среднем и большом расстоянии 2,3. Запахи, испускаемые хозяином или местом яйцекладки, обнаруживаются различными специфическими обонятельными рецепторами (например, GR, OR, IR), расположенными на хоботке, лапках и антеннах 2,3 щупика комара.
Поскольку обоняние является ключевым компонентом их поведения по поиску хозяина (растений и животных), спаривания и яйцекладки, он, таким образом, представляет собой идеальную цель для изучения с целью разработки новых инструментов для борьбы с комарами4. Исследования репеллентов (например, DEET, IR3535, пикаридин) и приманок (например, человеческая приманка BG Sentinel) чрезвычайно плодотворны5, но из-за текущих проблем в борьбе с комарами (например, устойчивость к инсектицидам, инвазивные виды) важно разработать новые эффективные методы борьбы, основанные на биологии комаров.
Многие методы (например, ольфактометр, анализы посадки, электрофизиология) использовались для оценки биологической активности соединений или смесей соединений у комаров. Среди них электроантеннография (или электроантеннограммы (EAG)) может быть использована для определения того, обнаруживаются ли одоранты усиками комаров. Этот метод был первоначально разработан Schneider6 и с тех пор использовался во многих различных родах насекомых, включая мотыльков 7,8,9, шмелей 10,11, медоносных пчел 12,13 и плодовых мушек14,15, и это лишь некоторые из них. Электроантеннография также использовалась с использованием различных протоколов, включая одну или несколько антенн у комаров 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Комары – относительно небольшие и нежные насекомые с довольно тонкими усиками. В то время как выполнение ЭАГ на более крупных насекомых, таких как мотыльки или шмели, относительно легко из-за их большего размера и более толстых усиков, проведение ЭАГ у комаров может быть сложной задачей. В частности, поддержание хорошего соотношения сигнал/шум и длительная оперативная подготовка являются двумя основными требованиями к воспроизводимости и надежности данных.
Предлагаемое здесь пошаговое руководство по малошумным EAG напрямую предлагает решения этих ограничений и делает этот протокол применимым к нескольким видам комаров из различных родов, включая Aedes, Anopheles, Culex и Toxorhynchites, и описывает технику как для самок, так и для самцов. Электроантеннография предлагает быстрый, но надежный способ скрининга и определения биологически активных соединений, которые затем могут быть использованы при разработке приманки после определения валентности с помощью поведенческих анализов.
Protocol
Representative Results
Discussion
На обонятельное опосредованное поведение влияет множество факторов, включая физиологические (например, возраст, время суток) и экологические (например, температура, относительная влажность)30. Таким образом, при проведении ЭАГ важно использовать насекомых, находящихся в о?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Я благодарен д-ру Клеману Виногеру и д-ру Джеффри Риффеллу за полезные дискуссии. Следующие реагенты были получены через BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, штамм STE2, MRA-128, предоставленный Марком К. Бенедиктом; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, предоставлено Дэвидом В. Северсоном; Culex quinquefasciatus, штамм JHB, яйца, NR-43025. Автор благодарит доктора Джейка Ту, доктора Нишу Дуггал, доктора Джеймса Вегера и Джеффри Марано за предоставление яиц комаров Culex quinquefasciatus и Anopheles stephensi (штамм: Liston). Aedes albopictus и Toxorhynchites rutilus septentrionalis получены от полевых комаров, собранных автором в районе долины Нью-Ривер (Вирджиния, США). Эта работа была поддержана Департаментом биохимии и Институтом наук о жизни Фралина.
Materials
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
References
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes: a review. International Journal of Tropical Insect Science. 12 (1-2-3), 287-295 (1991).
- Zwiebel, L. J., Takken, W. Olfactory regulation of mosquito-host interactions. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 645-652 (2004).
- Potter, C. J. Stop the biting: targeting a mosquito’s sense of smell. Cell. 156 (5), 878-881 (2014).
- Paluch, G., Bartholomay, L., Coats, J. Mosquito repellents: a review of chemical structure diversity and olfaction. Pest Management Science. 66 (9), 925-935 (2010).
- Schneider, D. Electrophysiological investigation on the antennal receptors of the silk moth during chemical and mechanical stimulation. Experientia. 13 (2), 89-91 (1957).
- Raguso, R. A., Light, D. M., Pickersky, E. Electroantennogram responses of Hyles lineata (Sphingidae: Lepidoptera) to volatile compounds from Clarkia breweri (Onagraceae) and other moth-pollinated flowers. Journal of Chemical Ecology. 22 (10), 1735-1766 (1996).
- Schweitzer, E. S., Sanes, J. R., Hildebrand, J. G. Ontogeny of electroantennogram responses in the moth, Manduca sexta. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 955-960 (1976).
- Martel, V., Anderson, P., Hansson, B. S., Schlyter, F. Peripheral modulation of olfaction by physiological state in the Egyptian leaf worm Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Physiology. 55 (9), 793-797 (2009).
- Spaethe, J., Brockmann, A., Halbig, C., Tautz, J. Size determines antennal sensitivity and behavioral threshold to odors in bumblebee workers. Naturwissenschaften. 94 (9), 733-739 (2007).
- Suchet, C., et al. Floral scent variation in two Antirrhinum majus subspecies influences the choice of naïve bumblebees. Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1015-1027 (2011).
- De Jong, R., Pham-Delègue, M. H. Electroantennogram responses related to olfactory conditioning in the honeybee (Apis mellifera ligustica). Journal of Insect Physiology. 37 (4), 319-324 (1991).
- Patte, F., Etcheto, M., Marfaing, P., Laffort, P. Electroantennogram stimulus-response curves for 59 odourants in the honeybee, Apis mellifica. Journal of Insect Physiology. 35 (9), 667-675 (1989).
- Alcorta, E. Characterization of the electroantennogram in Drosophila melanogaster and its use for identifying olfactory capture and transduction mutants. Journal of Neurophysiology. 65 (3), 702-714 (1991).
- Park, K. C., Ochieng, S. A., Zhu, J., Baker, T. C. Odor discrimination using insect electroantennogram responses from an insect antennal array. Chemical Senses. 27 (4), 343-352 (2002).
- Du, Y. J., Millar, J. G. Electroantennogram and oviposition bioassay responses of Culex quinquefasciatus and Culex tarsalis (Diptera: Culicidae) to chemicals in odors from Bermuda grass infusions. Journal of Medical Entomology. 36 (2), 158-166 (1999).
- Costantini, C., et al. Electroantennogram and behavioural responses of the malaria vector Anopheles gambiae to human-specific sweat components. Medical and Veterinary Entomology. 15 (3), 259-266 (2001).
- Collins, L. E., Blackwell, A. Electroantennogram studies of potential oviposition attractants for Toxorhynchites moctezuma and T. amboinensis mosquitoes. Physiological Entomology. 23 (3), 214-219 (1998).
- Seenivasagan, T., Sharma, K. R., Sekhar, K., Ganesan, K., Prakash, S., Vijayaraghavan, R. Electroantennogram, flight orientation, and oviposition responses of Aedes aegypti to the oviposition pheromone n-heneicosane. Parasitology Research. 104 (4), 827-833 (2009).
- Puri, S. N., Mendki, M. J., Sukumaran, D., Ganesan, K., Prakash, S., Sekhar, K. Electroantennogram and behavioral responses of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) females to chemicals found in human skin emanations. Journal of Medical Entomology. 43 (2), 207-213 (2014).
- Cooperband, M. F., McElfresh, J. S., Millar, J. G., Carde, R. T. Attraction of female Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) to odors from chicken feces. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1184-1192 (2008).
- Dekker, T., Ignell, R., Ghebru, M., Glinwood, R., Hopkins, R. Identification of mosquito repellent odours from Ocimum forskolei. Parasites & Vectors. 4 (1), 183 (2011).
- Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
- Wolff, G. H., Lahondère, C., Vinauger, C., Riffell, J. A. Neuromodulation and differential learning across mosquito species. bioRxiv. , 755017 (2019).
- Lahondère, C., et al. The olfactory basis of orchid pollination by mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (1), 708-716 (2020).
- Beyenbach, K., Masia, R. Membrane conductances of principal cells in Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48, 375-386 (2002).
- Oesterle, A. . The Pipette Cookbook. , (2018).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2018).
- Afify, A., Betz, J. F., Riabinina, O., Lahondère, C., Potter, C. J. Commonly used insect repellents hide human odors from Anopheles mosquitoes. Current Biology. 29 (21), 3669-3680 (2019).
- Martin, F., Riveron, J., Alcorta, E. Environmental temperature modulates olfactory reception in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 57 (12), 1631-1642 (2011).
- Qiu, Y. T., Gort, G., Torricelli, R., Takken, W., van Loon, J. J. Effects of blood-feeding on olfactory sensitivity of the malaria mosquito Anopheles gambiae: application of mixed linear models to account for repeated measurements. Journal of Insect Physiology. 59 (11), 1111-1118 (2013).
- Taylor, B., Jones, M. D. R. The circadian rhythm of flight activity in the mosquito Aedes aegypti (L.): the phase-setting effects of light-on and light off. Journal of Experimental Biology. 51 (1), 59-70 (1969).
- Eilerts, D. F., VanderGiessen, M., Bose, E. A., Broxton, K., Vinauger, C. Odor-specific daily rhythms in the olfactory sensitivity and behavior of Aedes aegypti mosquitoes. Insects. 9 (4), 147 (2018).
- Krishnan, B., Dryer, S. E., Hardin, P. E. Circadian rhythms in olfactory responses of Drosophila melanogaster. Nature. 400 (6742), 375-378 (1999).
- Pelletier, J., Guidolin, A., Syed, Z., Cornel, A. J., Leal, W. S. Knockdown of a mosquito odorant-binding protein involved in the sensitive detection of oviposition attractants. Journal of Chemical Ecology. 36 (3), 245-248 (2010).
