Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

A سريع الغذاء تفضيل المقايسة في دروسوفيليا

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62051
Automatic Translation
1, 1,2
1Monell Chemical Senses Center, 2Department of Physiology, The Diabetes Research Center, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Summary

نقدم بروتوكولاً لـ فحص تغذية خيارين للذباب هذا الخضوع للتغذية سريع وسهل التشغيل، وهو مناسب ليس فقط للبحوث المختبرية الصغيرة النطاق، ولكن أيضا للشاشات السلوكية عالية الإنتاجية في الذباب.

Abstract

لتحديد الغذاء ذات القيمة الغذائية مع تجنب استهلاك العوامل الضارة، تحتاج الحيوانات إلى نظام ذوق متطور وقوي لتقييم بيئتها الغذائية. ذبابة الفاكهة، Drosophila الميلانوغاستر، هو كائن حي نموذج قابل للخل وراثيا التي تستخدم على نطاق واسع لفك الأسس الجزيئية والخلوية والجسية من تفضيل الغذاء. لتحليل تفضيل الطعام الطائر ، هناك حاجة إلى طريقة تغذية قوية. وصف هنا هو اختبار التغذية خيارين، والتي هي صارمة، وتوفير التكاليف، وسريعة. المقايسة هي بيتري الطبق القائم على ويشمل إضافة اثنين من الأطعمة المختلفة تستكمل مع صبغة زرقاء أو حمراء إلى نصفي الطبق. ثم، ~ 70 prestarved، يتم وضع الذباب 2-4-day-4-العمر في الطبق ويسمح للاختيار بين الأطعمة الزرقاء والحمراء في الظلام لمدة 90 دقيقة تقريبا. ويتبع فحص البطن من كل ذبابة من حساب مؤشر تفضيل. على النقيض من لوحات متعددة، كل طبق بيتري يأخذ فقط ~ 20 s لملء ويوفر الوقت والجهد. يمكن استخدام هذا الفحص الغذائي لتحديد ما إذا كان الذباب مثل أو يكره طعامًا معينًا.

Introduction

على الرغم من الاختلافات الهائلة في البنية التشريحية لأعضاء الذوق بين الذباب والثدييات ، فإن الاستجابات السلوكية للذباب للعديد من المواد اللذيذة تشبه بشكل لافت للنظر تلك الخاصة بالثدييات. على سبيل المثال، يفضل الذباب السكر1،2،3،4،5،6،7،8،الأحماض الأمينية9،10،وانخفاض الملح11،والتي تشير إلى المواد الغذائية، ولكن رفض الأطعمة المريرة12،13،14،15 التي هي غير مستساغة أو سامة. على مدى العقدين الماضيين، وقد ثبت الذباب أن كائن حي نموذج قيمة للغاية لتعزيز فهم العديد من الأسئلة الأساسية المتعلقة الإحساس بالذوق واستهلاك المواد الغذائية، بما في ذلك الكشف عن لذيذ، نقل طعم، طعم اللدونة، والتغذية تنظيم16،17،18،19،20. ومن اللافت للنظر أن عددا من الدراسات أظهرت أن تحويل الذوق وآليات الدائرة العصبية الكامنة الكامنة في إدراك الذوق مماثلة بين ذباب الفاكهة والثدييات. لذلك ، فإن ذبابة الفاكهة بمثابة كائن تجريبي مثالي ، مما يتيح للباحثين الكشف عن المفاهيم والمبادئ المحفوظة تطورًا التي تحكم اكتشاف الطعام واستهلاكه في المملكة الحيوانية.

للتحقيق في الإحساس بالطعم في الذباب ، من الأهمية بمكان إنشاء فحص سريع وصارم لقياس تفضيل الطعام بموضوعية. على مر السنين ، وطرق التغذية المختلفة ، مثل المقايسات على أساس صبغ11،12،13،21،22،23، و يطير proboscis تمديد استجابة المقايسة24، تغذية شعرية (CAFE) مقايسة25،26، ذبابة السائل الغذاء التفاعل عداد (FLIC) اختبار27، وغيرها من أساليب combinatorial وضعت لقياس كميا تفضيل الغذاء و / أو تناول الطعام للذباب الفاكهة28،29،30،31. واحدة من نماذج التغذية الشعبية هو صبغ القائمة على اثنين من خيار اختبار التغذية باستخدام إما لوحة microtiter متعددةويل12،21،32 أو ، كما هو موضح هنا ، طبق بيتري صغيرة11،22 كما غرفة التغذية. تم تصميم هذا الفحص بناءً على شفافية بطن الذبابة. خلال هذا الفحص ، يتم وضع الذباب في غرفة التغذية وتقديمه مع خيارين من الطعام ممزوجاً إما بصبغة حمراء أو صبغة زرقاء. بمجرد اكتمال الفحص ، تظهر البطن تطير حمراء أو زرقاء اعتمادًا على الطعام الذي استهلكوه.

كل من بيتري طبق ومجرّات التغذية متعددة المستويات القائمة على صبغة هي قوية للغاية وتسفر عن نفس النتائج تقريبا. باستخدام هذه المقايستين ، تم تحقيق العديد من الاكتشافات الهامة والاختراقات نحو فك رموز المستقبلات والخلايا المتنوعة للغاية المسؤولة عن استشعار أذواق الطعام والملمس الغذائي11،12،21،22،32،33. في المقايسة القائمة على الصبغة، خطوة تجريبية واحدة تتطلب وقتا طويلا وجهدا هو إعداد وتحميل الطعام في غرفة التغذية. للحد من إعداد الطعام ووقت التحميل ، تم تعديل هذه المقايسة عن طريق استبدال لوحة microtiter متعددة الويل بطبق بيتري صغير ، والذي ينقسم إلى قسمين متساويين. في المقايسة التي تعتمد على طبق بيتري، يتم إضافة اثنين من الأطعمة المختلفة المكملة مع صبغة زرقاء أو حمراء إلى نصفي الطبق. ثم، ~ 70 prestarved، يتم وضع الذباب 2-4-day-4-العمر في الطبق ويسمح للاختيار بين الأطعمة الزرقاء والحمراء في الظلام لمدة 90 دقيقة تقريبا. ثم يتم فحص البطن من كل ذبابة، ويتم حساب مؤشر تفضيل (PI).

هذا بيتري طبق القائمة على اثنين من خيار اختبار التغذية بأسعار معقولة وبسيطة وسريعة. يتطلب لوح واحد متعدد المستويات حوالي 110 s لملء، في حين أن كل طبق بيتري يأخذ فقط ~20 s. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الصفيحة المتعددة الآبار تتطلب إدخال كميات صغيرة من الأغذية إلى عدد كبير من الآبار الصغيرة (مثل 60 بئراً أو أكثر لكل صفيحة)، الأمر الذي يتطلب قدراً كبيراً من الدقة والاهتمام. وعلى العكس من ذلك، يتطلب المقايسة القائمة على طبق بيتري إجراءين فقط لكل لوحة. كما يمكن أن تنطوي على فحص التغذية عدد كبير من النسخ المتماثلة، مقايسة بيتري الطبق القائم يوفر كمية غير تماثل من الوقت والجهد. هذا الفحص يعطي نتائج مكافئة لتلك التي من المقايسة متعددة القائم على الويل وقد ثبت نجاحه في معالجة العديد من الأسئلة الأساسية في الإحساس بالذوق، بما في ذلك الملح طعم الترميز11، طعم اللدونة المعدلة من تجربة الغذاء22، والأساس الجزيئي للالمسيج الغذائي الإحساس33. وخلاصة القول، إن هذا الفحص القائم على خيارين من بيتري-طبق هو أداة قوية للتحقيق في كيفية إدراك الذباب للأوساط الغذائية الخارجية والداخلية لانتزاع سلوك التغذية المناسب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تجميع الدوائر المقايسة

ملاحظة: في حين يصف هذا البروتوكول استخدام طبق بيتري 35 مم(الشكل 1A)،يمكن تحقيق التأثير المطلوب باستخدام أي وعاء محكم ومصون القاع يمكن أن يقسم ويغطى.

  1. أولاً، تقسيم طبق بيتري مصفى بـ 35 ملم من خلال تحديد طول من البلاستيك (5 مم في العرض و3 مم في الارتفاع) أسفل خط الوسط مع لاصق مقاوم للماء، مما يشكل مقصورتين محكمتين. تأكد من أن الختم كامل لتجنب التسرب الذي يمكن أن يؤدي إلى خلط ركائز الغذاء اثنين يجري اختبارها.
    ملاحظة: بعد التجميع، إعادة استخدام هذا الجهاز طالما الختم يحمل.

2. إعداد قارورة المجاعة

  1. إعداد عدد كاف من قارورة ذبابة بلاستيكية فارغة؛ ثم، فضفاضة ضغط قطعة من الورق الأنسجة في الجزء السفلي. ضغط ورقة الأنسجة بما فيه الكفاية أنه يملأ الفضاء، ولكن ليس كثيرا أنه يشكل كتلة كثيفة.
    ملاحظة: تأكد من عدم وجود شقوق عميقة أو طيات في الأنسجة، لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى الحصول على المحاصرين الذباب.
  2. إضافة ~ 3 مل الماء النقي إلى القارورة بحيث يتم تشبع الأنسجة تماما، ولكن لا يوجد ماء قائم. تأكد من عدم وجود قطرات كبيرة من المياه الزائدة على جدار القارورة. بدلا من ذلك، استبدال agarose للورق غارقة عن طريق إعداد 1٪ ث / الخامس agar الحل (دون السكروز) عن طريق إضافة 5 مل من 1٪ agarose إلى كل قارورة فارغة والسماح agarose لترسيخ في درجة حرارة الغرفة.

3. تجويع الرطب من الذباب قبل التجربة

  1. بدء المجاعة 24 ساعة قبل وقت التجربة. تحت CO2 التخدير، مجموعات فرز من ~ 70، 2-4-يوم من العمر الذباب في قارورة المجاعة المعدة، ووضع العلامات على كل قارورة مع النمط الجيني ووقت المجاعة.

4. الإعداد الكاشف

  1. إعداد الأصباغ
    ملاحظة: قبل إجراء أي تجارب، من المهم إجراء اختبار أولي لتحديد التركيزات الصحيحة من الأصباغ الحمراء والزرقاء لاستخدامها.
    1. للتشذيب التحكم، وإعداد مجموعة من التخفيفات لكل صبغة، وأداء مقايسة التغذية مع نفس الطعام مع لون صبغ مختلفة. استخدم النتائج لتحديد تركيزات الصبغتين (واحدة حمراء، واحدة زرقاء) التي تنتج PI من ~ 0 عند إضافة أي مركب تجريبي (انظر القسم 7).
      ملاحظة: على سبيل المثال، تم تثبيت تركيز الصبغة الزرقاء النهائي عند 50 ميكرومتر واختباره مقابل سلسلة من تركيزات الصبغة الحمراء. استنادا إلى منحنى جرعة صبغة حمراء، وكان التركيز الأمثل صبغة حمراء 210 μM، الذي أعطى الحد الأدنى من التحيز صبغ(الشكل 1B). أعلى تركيز صبغة حمراء يدفع الذباب إلى تفضيل الطعام الأحمر، في حين أن أقل تركيز يدفع الذباب إلى تفضيل الطعام الأزرق. صقل بعناية تركيزات الصبغة الزرقاء أو الحمراء بزيادات 1 ميكرومتر، حيث أن الاختلافات بهذا الحجم والأكبر يمكن أن تؤثر على النتائج التجريبية.
  2. إعداد 1٪ agarose
    1. الجمع بين 0.5 غرام agarose و 50 مل من المياه النقية (أو بعض منها متعددة) في وعاء آمن بالموجات الدقيقة. الميكروويف حل agarose حتى يذوب، واثارة ذلك حسب الحاجة.
  3. إعداد مكونات غذائية أخرى
    1. يذيب كل مكون غذائي، بما في ذلك السكروز وأي مركبات تجريبية، في الماء بتركيز 100 ضعف أو أعلى من التركيز النهائي الذي تم اختباره.
      ملاحظة: يجب ألا يتجاوز الحجم الإجمالي لكل مكون غذائي يضاف إلى 1٪ أجار 1 مل لكل 10 مل أجار منصهر. وإلا، قد يكون agarose مخففة جدا، وسوف لا تتوطد بشكل مناسب.
  4. إعداد وسائل الإعلام الغذائية
    1. مزيج أجار، صبغ، والمجمع التجريبي المطلوب في أنابيب الطرد المركزي البولي بروبلين المخروطية (15 أو 50 مل)؛ استخدام الماء بدلا من الطعم التجريبي في الغذاء التحكم. القيام بذلك في حين أن أجار لا يزال السائل تماما ومزيج تماما باستخدام خلاط دوامة. إبقاء الأنابيب في حمام مائي 60 درجة مئوية في حين لا تستخدم لمنع agarose من تصلب قبل أن توزع في أطباق.
  5. إعداد الأطباق للتجربة
    ملاحظة: تأكد من أن جميع الأطباق جافة تمامًا قبل البدء.
    1. Pipette 1 مل من المتوسط الأحمر التجريبية الغذاء في جانب واحد من طبق المقايسة(الشكل 1A); كرر العدد المطلوب من الأطباق. السماح لأغاروز لتبرد حتى شركة (3-5 دقيقة)، ثم ماص 1 مل من الغذاء التحكم الأزرق في الجانب الآخر من الأطباق (الشكل 1A). كرر هذه العملية مع التحكم الأحمر / التجريبية الأزرق الزوج.
      ملاحظة: تأكد من أن جميع الأطباق قد تم إعدادها بالكامل قبل بدء التجربة. استخدم الأطباق في غضون 30 دقيقة.

5. بدء فحص التغذية في الاتجاهين

  1. شل مؤقتا خطوط الطيران التجريبية على الجليد حتى لا يتم رصد أي أنشطة محركية واضحة مثل الطيران والتسلق. مرة واحدة يتم شل حركة الذباب، عكس بلطف القارورة، والاستفادة لنقل جميع الذباب في غرفة الفحص.
    ملاحظة: صدمة الباردة يستغرق ~ 3-5 دقيقة. التعرض لفترات طويلة للبرد قد يؤثر على فسيولوجيا الذبابة والصحة، وبالتالي ينبغي تجنبها.
  2. ضع الغطاء بسرعة على الغرفة واتركه جانباً. بمجرد أن يتم نقل جميع الذبابات، قم بنقل جميع الغرف إلى مساحة مظلمة ومغلقة. السماح للمجاح لتشغيل لمدة 90 دقيقة.
    ملاحظة: تقلل البيئة المظلمة من تأثير المسار البصري للذبابة على سلوك التغذية وتزيل أي إشارات بيئية من خارج الطبق.

6. إنهاء الطعم في الاتجاهين

  1. بعد مرور 90 دقيقة، قم بنقل الغرف إلى ثلاجة -20 درجة مئوية للتضحية بالذباب. بعد ~1 ساعة، عد الذباب.
    ملاحظة: عكس كل طبق بيتري قبل وضع الطبق في الثلاجة لضمان عدم تجميد الذباب على الطعام.

7. تعيين مؤشر تفضيل (PI) لتحديد تفضيل الأغذية

  1. تحت مجهر تشريح قياسي، فحص لون البطن الذباب 'في كل طبق على حدة. عد الذباب إما الأحمر أو الأزرق أو الأرجواني وفقا للون البطن (الشكل 2A). عد الذبابة إذا كان بطنها أكثر من 50٪ ملون، مما يدل على تغذية قوية(الشكل 2B). استبعاد ذبابة إذا كان يحتوي على بطنه بقعة الطعام صغيرة فقط، مما يدل على سوء الأكل (الشكل 2C).
  2. بعد أن تم حساب أعداد الذباب الذي يأكل الأزرق أو الأحمر أو الأطعمة الزرقاء والحمراء ، استخدم المعادلة التالية لتعيين كل طبق بيتري مؤشر تفضيل (PI):

PI = (عدد الذباب تناول الطعام التجريبي) - (عدد الذباب الأكل الغذاء التحكم) / (عدد الذباب الأكل الغذاء التجريبي) + (عدد الذباب الأكل الغذاء التحكم) + (عدد الذباب الأكل الغذاء التحكم) + (عدد الذباب الأكل على حد سواء)

يشير PI > 0 إلى تفضيل المركب التجريبي، ويشير PI < 0 إلى نفور من المركب التجريبي، ويشير PI = 0 إلى عدم تأثير المركب على سلوك التغذية.

8. تنظيف الدوائر المقايسة

  1. على الفور تنظيف أطباق بيتري عن طريق كشط من الركيزة الغذائية وشطفها مع الصابون غير معزز والماء. نقع أطباق بيتري بين عشية وضحاها في الماء المقطر. تحقق من أن الختم المقسم في كل طبق لا يزال محكمًا ، ثم اترك هواء الطبق جافًا.
    ملاحظة: بعد التأكد من عدم وجود agarose المتبقية أو صبغة تلطيخ، أطباق بيتري جاهزة للاستخدام مرة أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا الفحص، تم تقسيم طبق 35 مم إلى قسمين متساويين للتغذية، حيث يحتوي كل نصف من الطبق على طعام agarose إلى جانب صبغة زرقاء أو حمراء(الشكل 1A). لاستبعاد التحيز صبغ، تم صقل تركيزات صبغة زرقاء وحمراء بعناية لتحقيق تقريبي "0" PI عندما تم إضافة هذين الأصباغ فقط(الشكل 1B). مرة واحدة تم تحميل طبق بيتري مع الغذاء اختبارها، ~ 70 الرطب تجويع، تم نقل الذباب الكبار 2-4 يوما من العمر إلى الطبق، مما يسمح لهم بالاختيار بين خيارين الغذاء في الظلام. بعد 90 دقيقة، تم فحص لون البطن الذباب 'مع مجهر تشريح. عادة، والبطن ذبابة يظهر الأزرق أو الأحمر إذا كان الحيوان يستهلك في الغالب الأزرق أو الأحمر الغذاء (الشكل 2A)، على التوالي. إذا كانت الذبابة تستهلك كلا من الأزرق والأحمر، يتحول بطنها إلى اللون الأرجواني (الشكل 2A).

تم تسجيل الذباب تناول كميات كبيرة من المواد الغذائية (الشكل 2B)، في حين تخطي الذباب مع كمية غير كافية من الطعام (الشكل 2C). تمت مقارنة هذا المقايسة القائم على طبق بيتري إلى المقايسة المتعددة القائمة على لوحة. تظهر النتائج أن هاتين الطريقتين للتغذية تعطيان في الأساس نفس النتائج في فحص استجابات التغذية للطعام الحلو أو المر أو المالح في الذباب البري(الشكل 3A-C). وتجدر الإشارة إلى أنه أسرع بكثير لإعداد وتوزيع الطعام في طبق بيتري مما كان عليه في لوحة متعددة الآبار تحتوي على 60 بئراً(الشكل 3D). بالإجمال، المقايسة التي تعتمد على طبق بيتري هي طريقة تغذية قوية وسريعة يمكن استخدامها لتحديد تفضيل الطعام للذباب بسرعة.

Figure 1
الشكل 1: جهاز اختبار خيارين ومنحنى جرعة الصبغة. (أ) يتم استخدام نصفين من طبق بيتري لتقديم خيارين مختلفين من الطعام. نصف الطبق يحتوي على طعام أزرق مُصَوّل، والنصف الآخر يحتوي على طعام أحمر المُصَنّوغ. يتم وضع الذباب المُشَرَد في الطبق للسماح لهم باستهلاك أي طعام يفضلونه. (B) تفضيل الغذاء للذباب البري من النوع الذي يختار بين 1٪ agarose بالإضافة إلى 2 mM السكروز التي تحتوي إما 50 μM صبغة زرقاء أو تركيزات متفاوتة من الصبغة الحمراء. التركيز الأمثل للصبغة الحمراء هو 210 ميكرومتر. تمثل البيانات ± الخطأ القياسي في الوسط. لكل نقطة بيانات، n = 6 تجارب. تم اختبار ما يقرب من 70 الذباب في كل تجربة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: يطير لون البطن بعد تناول الطعام الأزرق والأحمر، أو كل من الأطعمة الزرقاء والأحمر. (أ) صور تمثيلية للذباب بعد تناول الطعام الأزرق (أعلى اليمين)، والطعام الأحمر (أعلى اليسار)، أو كليهما، مما يجعل البطن يظهر بنفسجي (أسفل). (ب) ذبابة تظهر استهلاك كاف من الأغذية الزرقاء. (C) ذبابة بعد تناول كمية صغيرة من الطعام الأزرق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تغذية الاستجابات لمختلف الذذتات في الذباب البري من النوع، ووقت تحميل الطعام ل60-جيدا لوحة مقابل بيتري طبق القائم على جهاز التغذية. (A) تفضيل الغذاء للذباب البرية من النوع اختيار بين 2 mM السكروز و 10 mM السكروز. ن = 12 التجارب، الطلاب غير المدفوعة t الاختبارات. (B) تفضيل الطعام في الذباب البري من النوع للأغذية التي تحتوي على 2 mM السكروز مع أو بدون 10 mM الكافيين. ن = 10 تجارب، اختبار t-للطالبغير المدفوعة. (C) تفضيل الغذاء في الذباب البري من النوع للأغذية التي تحتوي على 2 mM السكروز مع أو بدون 20 mM NaCl. ن = 10 تجارب، اختبار t-للطالبغير المدفوعة. (D) الوقت الذي يقضيه في ملء الطعام في طبق 60-well وطبق بيتري. n = 12 طبق أو أطباق، *p < 0.0001، اختبارات t-الطلابغير المدفوعة. 12- وتمثل البيانات ± الاختصارات في مجالات إدارة الإحصاءات: n.s. = لا تكون ذات دلالة إحصائية؛ SEM = خطأ قياسي في الوسط; NaCl = كلوريد الصوديوم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تتضمن هذه الطريقة عدة خطوات هامة حيث يمكن أن تحدث مشاكل. أولاً، تأكد من أن الذباب يبتلع كمية كافية من الطعام لتوفير بيانات مستقرة. إذا كان الذباب يأكل بشكل سيئ ، تأكد من أن الذباب قد تم تجويعه لمدة 24 ساعة على الأقل ، وأن الوسائط التجريبية تحتوي على الحد الأدنى من تركيز السكروز (2 mM). لمزيد من تحفيز استهلاك الطعام، إطالة فترة المجاعة الرطب إلى ما بعد 24 ساعة، اعتمادا على حالة الذباب الفسيولوجية. إذا فشل الكثير من الذباب في البقاء على قيد الحياة المجاعة لفترات طويلة، وضمان أن يتم إضافة ما يكفي من الماء إلى ورقة الأنسجة عند إجراء الرطب المجاعة في قارورة. تجنب المياه الزائدة التي قد تغرق الذباب. ثانياً، يميل الذباب إلى إظهار تحيز التغذية تجاه الصبغة الزرقاء أو الحمراء إذا لم تكن تركيزاتها متوازنة بعناية. يمكن أن يكون للاختلافات الصغيرة في تركيز الصبغة تأثيرات عميقة على التغذية(الشكل 1B). وهكذا، لمنع التحيز صبغ، وينبغي أن يكون تركيز صبغة دقيقة. إذا تأثر الذباب بالصبغة، قم بصقل تركيز الصبغة بعناية عند زيادة 1 ميكرومتر، ثم اختبر تركيبات صبغ مختلفة لتحديد زوج تركيز الصبغة الحمراء/الزرقاء التي تنتج PI = 0 عندما لا يتم إضافة أي مركب تجريبي باستثناء تركيز منخفض من السكروز (على سبيل المثال، 2 mM). وينبغي إعادة ضبط تنسيق الصبغة المثلى للصبغة الحمراء أو الزرقاء عند اختبار خطوط ذبابة جديدة أو بعد صنع مخزون جديد من الصبغة. ثالثا، تأكد من أن الحسبة مقيدة إلى 90 دقيقة. وفقا لدراسة سابقة22، يمكن أن تؤدي التغذية المطولة إلى التكيف مع الذوق أو إزالة الحساسية.

بالمقارنة مع تقنيات التغذية الأخرى ، مثل FLIC27 أو CAFE25 ، فإن هذا الفحص القائم على طبق بيتري يحتوي على الميزات والمزايا التالية: (1) البساطة: يتكون هذا الجهاز فقط من طبق بيتري صغير مقسم مع مقسم بلاستيكي. لأن الأطباق والفواصل البلاستيكية غير مكلفة وسهلة لتجميع، تجربة كاملة يتطلب سوى الحد الأدنى من الاستثمار. (2) النفعية: الجهاز القائم على طبق بيتري يسرع إلى حد كبير حتى المقايسة التغذية(الشكل 3D). عملية تسجيل الألوان هي أيضا سريعة ومباشرة باستخدام مجهر تشريح العادية. مع هذه الطريقة، يمكن اختبار تفضيل الذوق الذباب نحو عنصر غذائي معين بسرعة. وبالتالي، فهي مناسبة لكل من البحوث الصغيرة النطاق والشاشات الجينية على نطاق واسع. (3) الاستقرار: على النقيض من طرق التغذية الأخرى التي تحلل فقط عدد قليل من الذباب في كل جهاز، تسمح هذه الطريقة بالتكين من استجابات التغذية لعدد كبير من الذباب البالغ في وقت واحد، مما يقلل بشكل كبير من آثار الاختلافات في التغذية بين الذباب الفردي. وقد ثبت هذا صبغ القائمة على اثنين من خيار اختبار التغذية لتكون صارمة وقابلة للتكرار واستخدمت لعزل المسوخ ذبابة هامة مع عيوب في إدراك الأذواق والمواد الغذائية11,22,33.

كما يتضح من هذه النتائج، فإن المقايسة التي تستند إلى طبق بيتري تنتج أساسا نفس النتائج مثل مقايسة التغذية متعددة القائم على الويل للاستجابات الحلوة والمريرة والمالحة الذوق، على الرغم من أن اختبار بتري الطبق القائم يميل إلى أن يكون أصغر الاختلافات(الشكل 3A-C). خطوة واحدة تستغرق وقتا طويلا من المقايسة التغذية على أساس صبغ هو تصريف المواد الغذائية في غرفة التغذية. يمكن أن يكون الصفيح المتعدد الآبار، الذي يحتوي على 60 بئرًا أو أكثر، شاقًا لإعداده بسبب متطلبات تحميل طعام agarose المذاب بدقة في 60 بئرًا أو أكثر لكل طبق. هو أسرع بكثير لإعداد وتحميل الطعام في طبق بيتري من في لوحة متعددة، كما يحتوي على طبق بيتري اثنين فقط من حجرات منفصلة (الشكل 3D). وبالتالي، فإن هذه الطريقة المستندة إلى طبق بيتري لا تحافظ فقط على قوة المقايسة القائمة على الصبغة، ولكن أيضا يقلل بشكل كبير من الوقت والجهد الذي يقضيه في إعداد الفحص، وبالتالي زيادة كبيرة في قدرة وسرعة الرضاعة المقايسة. وبالتالي، يمكن استخدامها بسهولة لتحليل عدد كبير من خطوط الطيران، كما هو الحال في مشروع الشاشة الوراثية.

في حين أن المقايسات القائمة على الصبغة توفر وسيلة عالية الإنتاجية للدراسة بسبب بساطتها وسرعتها ، فإنها لا تستطيع التقاط معلومات حول الجوانب الكمية الأكثر تفصيلا للتغذية مثل المدة أو الحجم. للتغلب على هذه المشكلة، يمكن تركيب كاميرا عالية السرعة فوق الطبق، مما يكشف عن معلومات أكثر تفصيلا عن عملية التغذية، مثل مدة التغذية والتردد في كل غرفة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام عدة نماذج أخرى للتغذية لتكملة البيانات التي تم جمعها من التجارب القائمة على الصبغة. أجهزة التغذية التلقائية، مثل FLIC27 و البربوسك الذبابة وكاشف النشاط (FlyPAD)34، يمكن أن تسجل الديناميات الزمنية للتغذية. مقايسة CAFE25 أو مقايسات التغذية اليدوية35 يمكن قياس حجم الطعام المستهلك. ومع ذلك، فإن لهذه النهج محاذيرها الخاصة. على سبيل المثال، بالمقارنة مع طبق بيتري أو لوحة متعددة الويل، أجهزة التغذية التلقائية مكلفة للغاية لإعداد في المختبر. بالإضافة إلى ذلك، يقوم كل جهاز بذبذبات قليلة فقط في كل مرة، مما يجعله أكثر عرضة للتقلب في الحيوانات الفردية. كما يعتمد مقايسة CAFE على قدرة الذباب على المناورة أجسادهم حتى نهاية أنبوب الشعيرات الدموية المعلقة داخل غرفة التغذية، يمكن الخلط بين النتائج من قبل العاهات الحركية لا علاقة لها الإحساس بالذوق.

على الرغم من أن النهج الأخرى قوية في حد ذاتها، يمكن أن تكون المقايسات القائمة على الصبغة أداة أكثر كفاءة لاكتشاف وتحليل تفضيل الطعام بسرعة في الذباب. وعلاوة على ذلك، يمكن دمج الإعداد خيارين مع التقنيات المتطورة مثل optogenetics36 لمعالجة انتقائية وبحادة سلوك تغذية الذبابة. ويمكن القيام بذلك باستخدام نصف الطبق لتنشيط الضوء والنصف الآخر كتحكم غير نشط. التفعيل المباشر أو تعطيل خلايا عصبية معينة يساعد على تحديد ما إذا كان لها دور في تنظيم سلوكيات التغذية. باختصار، تظهر هذه النتائج أن اختبار التغذية القائم على طبق بيتري خيارين هو طريقة تغذية سريعة وقوية يمكن أن تساعد الباحثين على تحليل سلوك التغذية تحت مختلف الدول الفسيولوجية والتمثيل الغذائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن أي تضارب في المصالح أو مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتور تينغوي مي لمساعدته على تحسين فحص التغذية الذي يختاره خياران. كما يودون أن يشكروا صموئيل تشان ووايت كولميس على تعليقاتهما على المخطوطة. تم تمويل هذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة المنح R03 DC014787 (Y.V.Z.) وR01 DC018592 (Y.V.Z.) ومن قبل مؤسسة أمبروز مونيل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Petri dish Fisher Scientific 08-772E
Agarose Thomas Scientific C756P56
Clear adhesive Fisher Scientific NC9884114
Conical centrifuge tubes Fisher Scientific 05-527-90
Dissection microscope Amscope SM-2T-6WB-V331
FCF Brilliant Blue Wako Chemical 3844-45-9
Fly CO2 anesthesia setup Genesee Scientfic 59-114/54-104M
Fly incubator with programmable day/night cycle Powers Scientific Inc. IS33SD
Fly lines
Glass dish (microwave-safe)
Kimwipes Fisher Scientific 06-666A
Media storage bottle Fisher Scientific 50-192-9998
Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm
Plastic fly vials Genesee Scientific 32-116
Sucrose Millipore Sigma S9378
Sulforhodamine B Millipore Sigma S9012
Tastant compound of interest
Vortex mixer Benchmark Scientific BV1000
Water bath Fisher Scientific FSGPD05

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  2. Dahanukar, A., Foster, K., van der Goes van Naters, W. M., Carlson, J. R. A Gr receptor is required for response to the sugar trehalose in taste neurons of Drosophila. Nature Neuroscience. 4 (12), 1182-1186 (2001).
  3. Ueno, K., et al. Trehalose sensitivity in Drosophila correlates with mutations in and expression of the gustatory receptor gene Gr5a. Current Biology. 11 (18), 1451-1455 (2001).
  4. Fujii, S., et al. Drosophila sugar receptors in sweet taste perception, olfaction, and internal nutrient sensing. Current Biology. 25 (5), 621-627 (2015).
  5. Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
  6. Thorne, N., Chromey, C., Bray, S., Amrein, H. Taste perception and coding in Drosophila. Current Biology. 14 (12), 1065-1079 (2004).
  7. Slone, J., Daniels, J., Amrein, H. Sugar receptors in Drosophila. Current Biology. 17 (20), 1809-1816 (2007).
  8. Dus, M., et al. Nutrient sensor in the brain directs the action of the brain-gut axis in Drosophila. Neuron. 87 (1), 139-151 (2015).
  9. Toshima, N., Tanimura, T. Taste preference for amino acids is dependent on internal nutritional state in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Biology. 215 (16), 2827-2832 (2012).
  10. Melcher, C., Bader, R., Pankratz, M. J. Amino acids, taste circuits, and feeding behavior in Drosophila: towards understanding the psychology of feeding in flies and man. Journal of Endocrinology. 192 (3), 467-472 (2007).
  11. Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
  12. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  13. Moon, S. J., Kottgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Current Biology. 16 (18), 1812-1817 (2006).
  14. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Current Biology. 30 (1), 17-30 (2020).
  15. Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. Journal of Neuroscience. 32 (4), 1429-1435 (2012).
  16. Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Current Opinion in Neurobiology. 19 (4), 345-353 (2009).
  17. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
  18. Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
  19. Scott, K. Gustatory processing in Drosophila melanogaster. Annual Review of Entomology. 63, 15-30 (2018).
  20. Freeman, E. G., Dahanukar, A. Molecular neurobiology of Drosophila taste. Current Opinion in Neurobiology. 34, 140-148 (2015).
  21. Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
  22. Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nature Neuroscience. 16 (10), 1468-1476 (2013).
  23. Bantel, A. P., Tessier, C. R. Taste preference assay for adult Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e54403 (2016).
  24. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
  25. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
  26. Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder assay measures food intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55024 (2017).
  27. Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
  28. Yoshihara, M. Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3625 (2012).
  29. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
  30. Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
  31. Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e56900 (2018).
  32. Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19 (19), 1623-1627 (2009).
  33. Zhang, Y. V., Aikin, T. J., Li, Z., Montell, C. The basis of food texture sensation in Drosophila. Neuron. 91 (4), 863-877 (2016).
  34. Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
  35. Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8, 87 (2015).
  36. Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).

Tags

علم الأعصاب، الإصدار 168،
A سريع الغذاء تفضيل المقايسة في <em>دروسوفيليا</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mack, J. O., Zhang, Y. V. A Rapid… More

Mack, J. O., Zhang, Y. V. A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila. J. Vis. Exp. (168), e62051, doi:10.3791/62051 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter