我们介绍一种果蝇的双选进食实验方案。该进食实验操作快速简便，不仅适用于小规模实验室研究，也适用于果蝇的高通量行为筛选。
本文内容
摘要
摘要
为了在摄取具有营养价值的食物的同时避免摄入有害物质，动物需要一个复杂而稳健的味觉系统来评估其食物环境。Drosophila melanogaster（黑腹果蝇）是一种遗传操作简便的模式生物，被广泛用于解析食物偏好的分子、细胞和神经机制。为了分析果蝇的食物偏好，需要一种可靠且高效的喂养方法。本文描述了一种双选喂养实验法，该方法严谨、成本低且操作快速。该实验基于培养皿，将添加了蓝色或红色染料的两种不同食物分别置于培养皿的两个半区。随后，将约70只经过饥饿处理的2至4日龄果蝇放入培养皿中 ，在黑暗条件下让其自由选择摄食蓝色或红色食物，持续约90分钟。之后通过观察每只果蝇腹部的颜色，并计算偏好指数。与多孔板方法相比，每个培养皿填充耗时仅约20秒，节省了大量时间和操作成本。该喂养实验可用于快速判断果蝇对某种特定食物的喜好或厌恶程度。
引言
尽管果蝇与哺乳动物在味觉器官的解剖结构上存在显著差异，果蝇对许多味质物质的行为反应却与哺乳动物惊人地相似。例如，果蝇偏好表明营养存在的糖类1,2,3,4,5,6,7,8、氨基酸9,10和低浓度盐11，但会拒绝摄入难吃或有毒的苦味食物12,13,14,15。在过去的二十年中，果蝇已被证明是研究味觉感知和食物摄取相关诸多基本科学问题的极具价值的模式生物，包括味质检测、味觉转导、味觉可塑性以及摄食调控16,17,18,19,20。值得注意的是，大量研究已表明，果蝇与哺乳动物在味觉感知所依赖的味觉转导机制和神经环路机制上具有相似性。因此，果蝇是一种理想的实验生物，使研究人员能够揭示在动物界中调控食物探测与摄取的进化上保守的概念与原理。
为了研究果蝇的味觉感知，建立一种快速且严谨的实验方法以客观测量其食物偏好至关重要。多年来，已开发出多种摄食方法，用于定量测量果蝇的食物偏好和/或摄食量，包括基于染料的检测方法11,12,13,21,22,23、果蝇喙伸展反应检测24、毛细管摄食（CAFE）检测25,26、果蝇液体食物交互计数（FLIC）检测27以及其他组合方法28,29,30,31。其中一种常用摄食范式是基于染料的双选择摄食检测，该方法可使用多孔微孔板12,21,32或如本文所述的小型培养皿11,22作为摄食腔室。该检测方法基于果蝇腹部的透明特性设计。实验过程中，将果蝇放入摄食腔室，并提供两种食物选择，分别混合红色染料或蓝色染料。检测结束后，根据果蝇摄取的食物种类，其腹部呈现红色或蓝色。
培养皿和多孔板染料喂食实验均具有高度的稳健性，且结果大致相同。利用这两种实验方法，研究人员在解析感知食物味道和食物质地的多样化受体与细胞方面，已取得诸多重要发现与突破11,12,21,22,32,33。在染料喂食实验中，一个耗时耗力的实验步骤是将食物制备并装入喂食腔。为了减少食物准备和装载时间，该实验方法经过改进，用小型培养皿替代了多孔微量滴定板，并将培养皿分为两个相等的区域。在基于培养皿的实验中，将添加了蓝色或红色染料的两种不同食物分别加入培养皿的两个半区。随后，将约70只饥饿处理过的2至4日龄果蝇放入培养皿中，在黑暗条件下让其自由选择摄食蓝色或红色食物，持续约90分钟。之后观察每只果蝇的腹部着色情况，并计算偏好指数（PI）。
这种基于培养皿的双选摄食实验成本低、操作简单且快速。填充一块多孔板大约需要110秒，而每个培养皿仅需约20秒。此外，多孔板实验需要将少量食物精确加入大量小孔中（例如每块板60个或更多孔），对操作精度和注意力要求较高。相比之下，基于培养皿的实验每块板仅需执行两个操作步骤。由于摄食实验通常涉及大量重复样本，基于培养皿的方法可显著节省时间和工作量。该方法所得结果与多孔板实验相当，并已成功用于研究味觉感知中的多个基本问题，包括盐味编码11、由食物经验调节的味觉可塑性22，以及食物质构感知的分子基础33。总之，这种基于培养皿的双选实验是研究果蝇如何感知内外营养环境以引发适当摄食行为的有力工具。
方案
1. 组装检测室
注意：虽然本方案描述使用35 mm的培养皿（图1A），但也可使用任何可被平分且可加盖的防水、底部光滑的容器来达到理想效果。
- 首先，将一个带盖的 35 mm 培养皿沿中线剖分为二：用防水胶将一段塑料（宽 5 mm，高 3 mm）固定在培养皿中线上，形成两个不渗漏的独立腔室。需确认密封完全，以避免泄漏导致两种待测食物基质混合。
注意：组装完成后，只要密封完好，该装置可重复使用。
2. 准备饥饿瓶
- 准备足够数量的空塑料果蝇培养瓶；然后在瓶底松散地压实一小块纸巾。压实程度应足以填满瓶底空间，但不可过于紧密而形成致密团块。
注意：确保纸巾无较深的缝隙或褶皱，以免果蝇被困其中。 - 向瓶内加入约 3 mL 纯水，使纸巾完全饱和，但无积水。确保瓶壁上无较大的多余水滴。或者，可用琼脂糖替代浸湿的纸巾：通过向每个空瓶中加入 5 mL 1% w/v 琼脂糖溶液（不含蔗糖），并在室温下使其凝固，制备替代基质。
3. 实验前果蝇的饥饿处理
- 在实验前24小时开始饥饿处理。在CO2麻醉条件下，将约70只、2至4日龄的果蝇按基因型分组放入已准备好的饥饿培养管中，并在每根培养管上标注基因型和饥饿处理时间。
4. 试剂准备
- 染料的制备
注意：在进行任何实验之前，重要的是先进行预实验对照，以确定所用红色和蓝色染料的合适浓度。- 对照实验中，为每种染料配制一系列稀释浓度，并使用含不同颜色染料的相同食物进行摄食实验。利用实验结果确定两种染料的浓度（一种红色，一种蓝色），使得在未添加实验化合物时，摄食指数（PI）约为0（参见第7节）。
注意：例如，最终蓝色染料浓度固定为 50 µM，并与一系列红色染料浓度进行测试。根据红色染料的剂量曲线，最佳红色染料浓度为 210 µM，此时染料偏差最小（图1B）。较高的红色染料浓度会促使果蝇偏好红色食物，而较低的浓度则会促使果蝇偏好蓝色食物。应以1 µM为增量，仔细调整蓝色或红色染料的浓度，因为等于或大于该幅度的浓度差异均可能影响实验结果。
- 对照实验中，为每种染料配制一系列稀释浓度，并使用含不同颜色染料的相同食物进行摄食实验。利用实验结果确定两种染料的浓度（一种红色，一种蓝色），使得在未添加实验化合物时，摄食指数（PI）约为0（参见第7节）。
- 1% 琼脂糖的制备
- 将0.5 g琼脂糖与50 mL纯水（或按比例增加的相应倍数）混合 在微波炉适用的容器中加热琼脂糖溶液至完全溶解，必要时进行搅拌。
- 其他食物成分的制备
- 将每种食物成分（包括蔗糖和任何实验化合物）溶解于水中，配制成最终测试浓度100倍或更高浓度的溶液。
注意：添加到1%琼脂中的每种食物成分的总体积不应超过每10 mL熔融琼脂1 mL，否则琼脂糖浓度过低，将无法正常凝固。
- 将每种食物成分（包括蔗糖和任何实验化合物）溶解于水中，配制成最终测试浓度100倍或更高浓度的溶液。
- 食品培养基的制备
- 将琼脂、染料和所需的实验化合物加入锥形聚丙烯离心管（15 或 50 mL）中；对照食物中使用水代替实验性味物质。在琼脂仍完全呈液态时进行混合，并使用涡旋振荡器充分混匀。未使用时将离心管置于 60 °C 水浴中，以防止琼脂在分装入培养皿前凝固。
- 准备实验用的培养皿
注意：开始前请确保所有培养皿完全干燥。- 将1 mL红色实验性食物培养基用移液器加入检测培养皿的一侧（图1A）；根据需要重复此步骤至所需数量的培养皿。让琼脂糖冷却至凝固（3-5 分钟），然后用移液器将 1 mL 蓝色对照食物加入培养皿的另一侧（图1A）。对对照红色/实验蓝色组合重复此过程。
注意：实验开始前请确保所有培养皿已完全凝固，并在30分钟内使用。
- 将1 mL红色实验性食物培养基用移液器加入检测培养皿的一侧（图1A）；根据需要重复此步骤至所需数量的培养皿。让琼脂糖冷却至凝固（3-5 分钟），然后用移液器将 1 mL 蓝色对照食物加入培养皿的另一侧（图1A）。对对照红色/实验蓝色组合重复此过程。
5. 启动双向喂养实验
- 将实验果蝇品系暂时置于冰上使其麻痹，直至观察不到飞行和爬行等明显运动活动。果蝇 immobilized 后，轻轻倒置试管，轻敲以将所有果蝇转移至检测室。
注意：冷休克处理约需 3–5 分钟。长时间暴露于低温可能影响果蝇的生理状态和健康，应避免。 - 迅速将盖子盖在检测室上并放置一旁。待所有果蝇转移完成后，将所有检测室移至黑暗密闭空间。让实验持续运行 90 分钟。
注意：黑暗环境可最大限度减少果蝇视觉通路对摄食行为的影响，并消除培养皿外部的任何环境线索。
6. 终止双向喂养实验
- 90 分钟后，将培养室转移至 -20 °C 冰箱中以处死果蝇。约 1 小时后，统计果蝇数量。
注意：在将每个培养皿放入冰箱前应先将其倒置，以确保果蝇不会被冻结在培养基上。
7. 分配偏好指数（PI）以确定食物偏好
- 在标准解剖显微镜下，观察每个培养皿中果蝇的腹部颜色。根据其腹部颜色将果蝇计数为红色、蓝色或紫色（图2A）。若果蝇腹部着色面积超过50%，表明摄食充分，则将其计入（图2B）；若果蝇腹部仅有微小的食物斑点，表明摄食不良，则不予计入（图2C）。
- 在统计完摄取蓝色食物、红色食物或同时摄取蓝红两种食物的果蝇数量后，使用以下公式为每个培养皿计算偏好指数（preference index, PI）：
PI = （取食实验食物的果蝇数量 - 取食对照食物的果蝇数量）/（取食实验食物的果蝇数量 + 取食对照食物的果蝇数量 + 同时取食两种食物的果蝇数量）
PI > 0 表示对实验化合物有偏好，PI < 0 表示对实验化合物有厌恶，PI = 0 表示该化合物对摄食行为无影响。
8. 清洗检测室
- 立即清洁培养皿，刮除食物基质，并用无香味的肥皂和水冲洗。将培养皿在蒸馏水中浸泡过夜。检查每个培养皿的分隔密封是否仍然防水，然后让培养皿自然晾干。
注意：确认无残留琼脂糖或染料染色后，培养皿即可再次使用。
结果
在本实验中，将一个35 mm的培养皿分为两个相等的取食区域，培养皿的每一半均含有与蓝色或红色染料偶联的琼脂糖食物（图1A）。为排除染料偏好性的影响，通过精细优化蓝色和红色染料的浓度，使得仅加入这两种染料时，摄食偏好指数（PI）接近“0”（图1B）。当培养皿中加入待测食物后，将约70只经过湿润饥饿处理的2-4日龄成年果蝇转移至培养皿中，使其在黑暗条件下自由选择两种食物。90分钟后，使用解剖显微镜观察果蝇腹部的颜色。通常情况下，若果蝇主要摄取蓝色或红色食物，其腹部分别呈现蓝色或红色（图2A）；若果蝇同时摄取蓝色和红色食物，则其腹部呈现紫色（图2A）。
摄入大量食物的果蝇被记录下来（图2B），而摄入食物不足的果蝇则被排除（图2C）。将基于培养皿的检测方法与基于多孔板的检测方法进行了比较。结果表明，这两种摄食方法在检测野生型果蝇对甜味、苦味或咸味食物的摄食反应时，所得结果基本一致（图3A-C）。值得注意的是，与含有60个孔的多孔板相比，制备和分配培养皿中的食物要快得多（图3D）。综上所述，基于培养皿的检测方法是一种稳定且快速的摄食实验方法，可用于快速确定果蝇的食物偏好。
图 1：双选择实验装置及染料剂量曲线。 （A）使用培养皿的两个半区来提供两种不同的食物选择。培养皿的一半含有蓝色染料标记的食物，另一半含有红色染料标记的食物。将预先饥饿处理的果蝇放入培养皿中，使其自由摄取其偏好的食物。（B）野生型果蝇在含有1%琼脂糖加2 mM蔗糖的食物之间进行选择时的食物偏好，其中一种添加50 µM蓝色染料，另一种添加不同浓度的红色染料。红色染料的最佳浓度为210 µM。数据表示为均值±标准误差。每个数据点包含n = 6次重复实验，每次实验约测试70只果蝇。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：果蝇摄取蓝色、红色或同时摄取蓝红两种食物后的腹部颜色变化。（A）果蝇摄取蓝色食物（右上）、红色食物（左上）或同时摄取两种食物后（下），腹部呈现紫色的代表性图像。（B）一只充分摄取了蓝色食物的果蝇。（C）一只仅摄取少量蓝色食物的果蝇。请点击此处查看该图的高清版本。
图3野生型果蝇对不同味觉刺激物的摄食反应，以及60孔板与培养皿为基础的摄食装置的加样时间。 (A野生型果蝇在2 mM蔗糖与10 mM蔗糖之间的食物偏好。n = 12次试验，非配对Student's t测试。B野生型果蝇对含有2 mM蔗糖且含或不含10 mM咖啡因的食物的偏好性。n = 10次试验，非配对Student's t检验 t-测试。C野生型果蝇对含有2 mM蔗糖且含或不含20 mM NaCl的食物的偏好性。n = 10次试验，非配对Student's t检验 t测试。D填充食物至60孔板和培养皿所用时间。n = 12 个孔板或培养皿，*p < 0.0001，非配对学生t检验 t-检验。数据表示为均值 ± 标准误。缩写：n.s. = 无统计学显著性；SEM = 均值标准误；NaCl = 氯化钠。 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
该方法包含多个关键步骤，其中可能出现问题。首先，需确保果蝇摄入足量的食物，以获得稳定的数据。如果果蝇进食不佳，应确保其已进行至少24小时的湿饥饿处理，并且实验培养基中含有至少最低限度的蔗糖浓度（2 mM）。为进一步促进摄食，可根据果蝇的生理状态将湿饥饿时间延长至24小时以上。若过多果蝇无法耐受延长的饥饿时间，请确保在试管中进行湿饥饿处理时，向滤纸中添加足够的水分，但避免水分过多导致果蝇溺亡。其次，若蓝色和红色染料的浓度未精确平衡，果蝇往往会对其中一种染料产生摄食偏好。染料浓度的微小差异都可能对摄食行为产生显著影响（图1B）。因此，为避免染料偏好，必须精确控制染料浓度。如果发现果蝇对染料存在偏好，应以1 µM为增量精细调整染料浓度，并测试不同的染料组合，以确定在仅添加低浓度蔗糖（例如2 mM）而无其他实验化合物时，能使偏好指数（PI）等于0的红/蓝染料浓度配对。在测试新的果蝇品系或配制新的染料储备液后，应重新优化红色或蓝色染料的浓度。第三，务必确保实验时长严格控制在90分钟以内。根据先前的研究22 ，长时间摄食可能导致味觉适应或敏感性下降。
与其他摄食技术（如FLIC27或CAFE25检测）相比，这种基于培养皿的双选实验具有以下特点和优势：（1）简便性：该装置仅由一个被塑料分隔板均分为两部分的小型培养皿组成。由于培养皿和塑料分隔板价格低廉且易于组装，整个实验所需投入极低。（2）高效性：基于培养皿的装置显著加快了摄食检测的速度（图3D）。使用常规解剖显微镜进行颜色评分的过程也快速而简便。利用该方法，可快速检测果蝇对特定食物成分的味觉偏好，因此既适用于小规模研究，也适用于大规模遗传筛选。（3）稳定性：与其他每装置仅分析少数几只果蝇的摄食方法不同，该方法可同时定量大量成年果蝇的摄食反应，从而显著降低了个体果蝇间摄食差异所带来的影响。这种基于染料的双选摄食实验已被证明具有严谨性和可重复性，并已成功用于分离在感知食物味道和质地方面存在缺陷的重要果蝇突变体11,22,33。
如结果所示，基于培养皿的取食实验在甜味、苦味和咸味味觉反应方面产生的结果与基于多孔板的取食实验基本一致，但基于培养皿的方法变异程度通常更小（图3A-C）。染料标记取食实验中一个耗时的步骤是将食物装入取食腔室。多孔板包含60个或更多的孔，每块板均需精确地将熔化的琼脂糖食物加入60个或更多的孔中，因此准备过程较为费力。相比之下，由于培养皿仅包含两个独立的区域，其食物的制备和装载速度明显快于多孔板（图3D）。因此，这种基于培养皿的方法不仅保持了染料标记实验的可靠性，还显著减少了实验准备所需的时间和工作量，从而大幅提高了取食实验的通量和速度。该方法可便捷地用于分析大量果蝇品系，例如在遗传筛选项目中应用。
尽管基于染料的检测方法因其操作简便、速度快，为研究提供了高通量的途径，但无法获取摄食行为中更详细的定量信息，例如摄食持续时间或摄食量。为克服这一局限，可在培养皿上方安装高速摄像机，以记录更详细的摄食过程信息，例如每个腔室中摄食的持续时间与频率。此外，还可采用多种其他摄食研究范式，以补充染料法所获得的数据。自动摄食装置，例如FLIC27和果蝇喙管与活动检测器（FlyPAD）34，能够记录摄食行为的时间动态。CAFE检测法25或手动摄食检测法35可用于测量摄食的食物体积。然而，这些方法也存在各自的局限性。例如，与培养皿或多孔板相比，自动摄食装置在实验室中的搭建成本非常高昂。此外，每台设备一次仅能检测少数几只果蝇，因而更容易受到个体动物间变异的影响。由于CAFE检测法依赖果蝇通过身体移动至摄食腔室内悬挂的毛细管末端进行取食，因此与味觉感知无关的运动功能障碍可能干扰实验结果。
尽管其他方法本身具有强大优势，但基于染料的检测方法可能是快速发现和分析果蝇食物偏好的更高效工具。此外，双选实验装置可与光遗传学等前沿技术相结合36，以选择性且急性地操控果蝇的摄食行为。该操作可通过将培养皿的一半用于光激活，另一半作为无光刺激的对照来实现。直接激活或抑制特定神经元有助于确定其是否在调控摄食行为中发挥作用。总之，这些结果表明，基于培养皿的双选摄食实验是一种快速且可靠的摄食研究方法，可帮助研究人员分析不同生理和代谢状态下果蝇的摄食行为。
披露
作者声明不存在利益冲突或竞争性经济利益。
致谢
作者感谢Tingwei Mi博士在优化双选摄食实验方面提供的帮助。作者还感谢Samuel Chan和Wyatt Koolmees对稿件提出的修改意见。本项目由美国国立卫生研究院资助，资助编号为R03 DC014787（Y.V.Z.）和R01 DC018592（Y.V.Z.），以及由安布罗斯·莫内尔基金会资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 35 mm 培养皿 | Fisher Scientific | 08-772E | |
| 琼脂糖 | Thomas Scientific | C756P56 | |
| 透明粘合剂 | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| 锥形离心管 | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 解剖显微镜 | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF 亮蓝 | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 麻醉装置 | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| 具有可编程昼夜循环的果蝇培养箱 | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| 果蝇品系 | |||
| 玻璃培养皿（可微波加热） | |||
| 吸水纸（Kimwipes） | Fisher Scientific | 06-666A | |
| 培养基储存瓶 | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| 塑料分隔板（从厚度不超过 5 mm 的塑料板上裁剪以适配培养皿） | |||
| 塑料果蝇培养管 | Genesee Scientific | 32-116 | |
| 蔗糖 | Millipore Sigma | S9378 | |
| 磺基罗丹明 B | Millipore Sigma | S9012 | |
| 待研究的味觉刺激化合物 | |||
| 涡旋混合器 | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| 水浴锅 | Fisher Scientific | FSGPD05 |
参考文献
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