Summary
我们提出了一个协议，为苍蝇的两种选择喂养检测。这种喂养检测是快速和容易运行，不仅适用于小型实验室研究，而且适用于高通量的行为屏幕在苍蝇。
Abstract
为了选择具有营养价值的食物，同时避免食用有害物质，动物需要一个复杂而坚固的味觉系统来评估它们的食物环境。果蝇， 果蝇黑色素酯，是一种可遗传的模型生物体，广泛用于破译食物偏好的分子、细胞和神经基础。为了分析飞行食物偏好，需要一种可靠的喂养方法。这里描述的是一个两种选择的喂养检测，这是严格的，节约成本，和快速。检测是基于培养皿的，包括在菜的两半添加两种不同的食物，辅以蓝色或红色染料。然后，~70只预先饿倒的2-4天大的苍蝇被放在盘子里，允许在黑暗中选择蓝色和红色食物约90分钟。检查每只苍蝇的腹部后，计算偏好指数。与多井盘相比，每道 Petri 菜只需 20 英镑就可装满并节省时间和精力。这种喂养分析可以用来快速确定苍蝇喜欢还是不喜欢特定的食物。
Introduction
尽管苍蝇和哺乳动物之间味觉器官的解剖结构存在巨大差异，但苍蝇对许多美味物质的行为反应与哺乳动物的行为反应惊人地相似。例如，苍蝇喜欢糖1，2，3，4，5，6，7，8，氨基酸9，10和低盐11，这表明营养物质，但拒绝苦味食物12，13，14，15是令人不快的或有毒的。在过去的二十年里，苍蝇被证明是一个极有价值的模型生物体，可以促进对许多与味觉和食物消费有关的基本问题的理解，包括美味检测、味觉转化、味觉可塑性以及喂养条例16、17、18、19、20。值得注意的是，许多研究表明，味觉感知背后的味觉转导和神经回路机制在果蝇和哺乳动物之间是相似的。因此，果蝇是一种理想的实验生物体，使研究人员能够发现在动物王国中控制食物检测和消费的进化保存的概念和原则。
要调查苍蝇的味觉，必须建立快速严谨的检测，以客观地测量食物偏好。多年来，各种喂养方法， 如染料检测11，12，13，21，22，23，苍蝇前体延伸反应检测24，毛细毛细木饲料（CAFE）检测25，26日，飞液体-食物互动计数器（FLIC）检测27，和其他组合方法已经开发，以定量测量食物偏好和/或食物摄入量果蝇28，29，30，31。流行的喂养模式之一是基于染料的两种选择喂养分析，使用多井微提器板12，21，32或，如这里描述，一个小的培养皿11，22作为喂养室。这种检测是基于苍蝇腹部的透明度设计的。在此检测过程中，苍蝇被放入喂食室，并呈现两种与红色染料或蓝色染料混合的食物选择。一旦检测完成，飞行腹部就会出现红色或蓝色，这取决于它们食用了哪些食物。
培养皿和多井板染料为基础的进料检测都非常坚固，其结果大致相同。利用这两种检测，在破译高度多样化的受体和细胞方面取得了许多重要的发现和突破，这些受体和细胞负责感应食物的味道和食物质地11、12、21、22、32、33。在基于染料的检测中，需要大量时间和精力的实验步骤是准备和装载食物到喂养室。为了减少食物的准备和装载时间，这种检测通过用小培养皿代替多井微提器板进行了修改，小培养皿被分成两个相等的隔间。在基于培养皿的检测中，在菜的两半中加入两种不同的食物，辅以蓝色或红色染料。然后，~70只预先饿倒的2-4天大的苍蝇被放在盘子里，允许在黑暗中选择蓝色和红色食物约90分钟。然后检查每只苍蝇的腹部，并计算偏好指数（PI）。
这种基于培养皿的两选择喂养检测是负担得起的，简单和快速的。一个多井盘需要大约110s来填充，而每个培养皿只需要~20s。此外，多井板需要将少量食物输送到大量的小井中（例如，每平板60口或更多的水井），这需要相当的精确性和注意度。相反，基于培养皿的检测每盘只需要两个操作。由于喂养检测可以涉及大量的复制品，基于培养皿的检测可以节省非平凡的时间和精力。这种检测结果相当于来自多井测定的结果，并已证明成功地解决了许多基本问题的味道感觉，包括盐味编码11，味道可塑性修改的食物经验22，和食物质地感觉的分子基础33。总之，这种基于培养皿的两选检测是研究苍蝇如何感知外部和内部营养环境以引起适当喂养行为的有力工具。
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Protocol
1. 组装化验室
注：虽然此协议描述了 35 mm Petri 盘 （图 1A）的使用，但使用任何可分割和覆盖的防水、平底容器都能达到所需的效果。
- 首先，用防水胶粘剂将一个35毫米的盖子将一个35毫米的培养皿固定在中线下方，形成两个防水隔间。确认密封是完整的，以避免泄漏，可能导致两个食物基板被检测混合。
注：组装后，只要密封保持，重复使用此设备。
2. 准备饥饿小瓶
- 准备足够数量的空塑料飞瓶：然后，松散地压缩一块纸巾在底部。压缩足够的纸巾，它填补了空间，但没有那么多，它形成一个密集的质量。
注意：确保组织内没有深缝隙或褶皱，因为这可能导致苍蝇被困。 - 将~3 mL纯净水加入小瓶中，使组织完全饱和，但没有常备水。确保瓶壁上没有大滴多余的水。或者，通过准备一个1%的w/v agar溶液（无蔗糖），通过在每个空小瓶中加入5 mL 1%的阿加罗斯，让阿加罗斯在室温下凝固，来代替浸泡的纸张。
3. 实验前苍蝇的湿饿
- 在实验开始前24小时开始饥饿。在CO2 麻醉下，分组的~70，2-4天大的苍蝇进入准备饥饿小瓶，标记每瓶与基因型和饥饿时间。
4. 试剂设置
- 染料制备
注：在进行任何实验之前，必须进行初步控制检测，以确定使用红色和蓝色染料的正确浓度。- 对于对照检测，为每种染料准备一系列稀释剂，并使用具有不同染料颜色的相同食物进行喂养检测。使用结果识别两染料浓度（一个红色，一个蓝色），当未添加实验化合物时，产生的 PI 为 =0（见第 7 节）。
注：例如，最终的蓝色染料浓度固定在 50 μM，并针对一系列红色染料浓度进行测试。根据红色染料剂量曲线，最佳红色染料浓度为 210 μM，从而给出最小的染料偏差（图 1B）。较高的红色染料浓度驱使苍蝇喜欢红色食物，而浓度较低的驱动器驱动苍蝇更喜欢蓝色食物。仔细提炼蓝色或红色染料浓度，增量为 1 μM，因为这种幅度和更大的差异会影响实验结果。
- 对于对照检测，为每种染料准备一系列稀释剂，并使用具有不同染料颜色的相同食物进行喂养检测。使用结果识别两染料浓度（一个红色，一个蓝色），当未添加实验化合物时，产生的 PI 为 =0（见第 7 节）。
- 准备 1% 阿加罗斯
- 将 0.5 克阿加罗斯和 50 mL 纯净水（或一些多重纯净水）组合在微波安全容器中。微波藻溶液，直到溶解，根据需要搅拌。
- 制备其他食品成分
- 以最终测试浓度的100倍或更高的浓度溶解水中的每种食物成分，包括蔗糖和任何实验化合物。
注：每10 mL熔融琼脂添加1%的食品成分总量不应超过1 mL。否则，阿加罗斯可能太稀释，不会适当凝固。
- 以最终测试浓度的100倍或更高的浓度溶解水中的每种食物成分，包括蔗糖和任何实验化合物。
- 食品介质的准备
- 在圆锥形聚丙烯离心管（15或50 mL）中混合琼脂、染料和所需的实验化合物：在对照食品中使用水而不是实验性美味。这样做，而琼脂仍然是完全液体和混合彻底使用涡流搅拌机。将管子放在 60 °C 的水浴中，同时不使用以防止藻类硬化，然后再分发到盘子中。
- 为实验准备菜肴
注意：请确保所有菜肴在开始之前完全干燥。- 派珀特 1 mL 的红色实验食品介质进入测定盘的一侧 （图 1A）：重复所需的菜数。让阿加罗斯冷却，直到坚定（3-5分钟），然后移液器1 mL的蓝色控制食品到菜的另一边（图1A）。用对照红色/实验蓝色对重复此过程。
注意：在开始实验之前，请确保所有菜肴都已完全设置好。在30分钟内使用菜肴。
- 派珀特 1 mL 的红色实验食品介质进入测定盘的一侧 （图 1A）：重复所需的菜数。让阿加罗斯冷却，直到坚定（3-5分钟），然后移液器1 mL的蓝色控制食品到菜的另一边（图1A）。用对照红色/实验蓝色对重复此过程。
5. 启动双向喂养检测
- 暂时瘫痪实验飞行线在冰上，直到没有明显的运动活动，如飞行和攀登观察。一旦苍蝇被固定，轻轻地倒置小瓶，并点击转移所有的苍蝇到检测室。
注：冷冲击需要~3-5分钟。长时间暴露在寒冷中可能会影响苍蝇的生理和健康，因此应避免。 - 快速将盖子放在房间上并放在一边。一旦所有的苍蝇被转移，移动所有的房间到一个黑暗的，封闭的空间。允许检测运行 90 分钟。
注意：黑暗的环境最大限度地减少了苍蝇的视觉路径对喂养行为的影响，并消除了菜外的任何环境线索。
6. 终止双向喂养检测
- 90分钟后，将腔室转移到-20°C的冰柜中，以牺牲苍蝇。1小时后，数一数苍蝇。
注意：在将菜放入冰箱之前，先倒置每道培养皿，以确保不会将苍蝇冷冻到食物上。
7. 分配偏好指数（PI）以确定食物偏好
- 在标准解剖显微镜下，检查每道菜中的苍蝇腹部颜色。根据苍蝇腹部的颜色（图2A），将苍蝇算作红色、蓝色或紫色。如果苍蝇的腹部颜色超过50%，则计算它，表示强大的喂养（图2B）。如果苍蝇的腹部只含有一个微小的食物点，表明饮食不良（图2C），则将其排除在外。
- 在计算了吃蓝色、红色或蓝色和红色食物的苍蝇数量后，使用以下方程为每道 Petri 菜分配偏好索引 （PI）：
PI = （吃实验食品的苍蝇数量） - （吃控制食品的苍蝇数量） / （吃实验食品的苍蝇数量） + （吃控制食品的苍蝇数量） + （吃两种食物的苍蝇数量）
PI > 0 表示对实验化合物的偏好，PI < 0 表示对实验化合物的厌恶，PI = 0 表示该化合物对喂养行为没有影响。
8. 清洁检测室
- 通过刮掉食物基板，用无香味的肥皂和水冲洗，及时清洁培养皿。将培养皿浸泡在蒸馏水中过夜。检查每道菜中的分隔密封是否仍然防水，然后让菜中空气干燥。
注：在确保没有残留的阿加罗斯或染料染色后，培养皿可以再次使用。
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Representative Results
在此分析中，35 毫米的菜被分成两个相等的喂食隔间，每一半菜中含有阿加罗斯食物，外加蓝色或红色染料（图 1A）。为了排除染料偏差，蓝色和红色染料浓度经过仔细精炼，仅添加这两种染料（图 1B）时，可产生大致的"0"PI。一旦培养皿装载了经过测试的食物，70只湿饿的2-4天大的成年苍蝇被转移到菜中，允许它们在黑暗中选择两种食物。90分钟后，用解剖显微镜检查苍蝇的腹部颜色。通常，如果动物主要食用蓝色或红色食物（图2A），苍蝇腹部会出现蓝色或红色。如果苍蝇同时消耗蓝色和红色，它的腹部就会变成紫色（图2A）。
摄入大量食物的苍蝇被评分（图2B），同时跳过食物摄入不足的苍蝇（图2C）。这种基于培养皿的检测与基于多井板的检测进行了比较。结果表明，这两种喂养方法对野生苍蝇的甜、苦或咸食物的喂养反应基本相同（图3A-C）。值得注意的是，在培养皿中准备和分发食物的速度比在包含 60 口井的多井盘中（图 3D）要快得多。总之，基于培养皿的检测是一种坚固而快速的喂养方法，可用于快速确定对苍蝇的食物偏好。
图1：两选测定装置和染料剂量曲线。 （A） 培养皿的两半用于呈现两种不同的食物选择。菜的一半含有蓝染食物，另一半含有红染色食物。预先饥饿的苍蝇被放入菜中，允许它们食用任何他们喜欢的食物。（B） 野生型苍蝇的食物偏好，选择1%的阿加罗斯加2 mM蔗糖含有50μM蓝色染料或不同浓度的红色染料。最佳红色染料浓度为 210 μM。数据表示均值的平均±标准误差。对于每个数据点，n=6个试验。每次试验中测试了大约70只苍蝇。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：食用蓝色、红色或蓝色和红色食物后腹部颜色。 （A）摄入蓝色食物（右上）、红色食物（左上）或两者兼有，使腹部呈紫色（下图）。（B） 显示足够食用蓝色食物的苍蝇。（C） 摄入少量蓝色食物后，一只苍蝇。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3：野生型苍蝇对不同美味佳肴的喂养反应，以及60个井板与基于培养皿的喂养装置的食物加载时间。 （A）野生型苍蝇在2米蔗糖和10米蔗糖之间选择的食物偏好。n=12项试验，未对学生的t-测试。（B） 野生型苍蝇的食物偏好，即含有2毫克蔗糖的食物，含或不含10毫克咖啡因。n=10项试验，未修学生的t-测试。（C） 野生型苍蝇的食物偏好，用于含有2 mM蔗糖的食物，有或没有20mM NaCl。n=10项试验，未修学生的t-测试。（D） 将食物放入60口井的盘子和培养皿中的时间。n=12盘或菜，*p<0.0001，未修修补修的学生t-测试。 数据表示平均±SEM.缩写：n.s.=没有统计学意义;SEM=平均值的标准错误：纳克=氯化钠。请点击这里查看此数字的较大版本。
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Discussion
此方法涉及几个可能出现问题的关键步骤。首先，确保苍蝇摄入足够的食物，以提供稳定的数据。如果苍蝇吃得不好，请确保苍蝇至少24小时被湿饿，并且实验介质中至少含有最少的蔗糖浓度（2米）。为了进一步刺激食物的消费，根据苍蝇的生理状况，将湿饥饿期延长到24小时以上。如果过多的苍蝇在长期饥饿中无法生存，请确保在小瓶中进行湿饥饿时，在纸巾中加入足够的水。避免过量的水，可能会淹死苍蝇。其次，如果苍蝇的浓度不仔细平衡，它们往往会表现出对蓝色或红色染料的喂养偏差。染料浓度的小变化可以产生深远的喂养作用（图1B）。因此，为了防止染料偏差，染料浓度应精确。如果苍蝇受到染料的影响，小心地以 1 μM 的增量细化染料浓度，然后测试不同的染料组合，以确定红/蓝染料浓度对，当添加低浓度的蔗糖（例如 2 mM）之外，没有实验化合物时产生 PI = 0。在测试新飞线时或在制造新的染料库存后，应重新调整最佳的红色或蓝色染料配合。第三，确保检测限制在 90 分钟以内。根据先前的研究22，长时间的喂养会导致味觉适应或脱敏。
与其他喂养技术（如FLIC27或CAFE25检测）相比，这种基于培养皿的两选检测具有以下特点和优点：（1） 简单性：（1） 简单性：该设备仅包括一个带塑料分隔器的小型 Petri 盘。由于餐具和塑料分隔板价格低廉且易于组装，因此整个实验只需要最少的投资。（2） 权宜之计：基于培养皿的装置大大加快了喂养检测（图3D）。使用常规解剖显微镜，分色过程也非常快速和简单。使用这种方法，苍蝇对特定食物成分的口味偏好可以快速测试。因此，它既适合小型研究，也适合大型基因筛选。（3） 稳定性：与其他只分析每个装置中几只苍蝇的喂养方法相比，该方法允许一次量化大量成年苍蝇的喂养反应，从而显著减少单个苍蝇之间喂养变化的影响。这种基于染料的两种选择喂养检测已被证明是严格和可重复的，并已被用来隔离重要的苍蝇突变体与缺陷，在感知食物的味道和质地11，22，33。
正如这些结果所证明的，基于培养皿的检测结果与基于多井的甜味、苦味和咸味反应的进料检测结果基本相同，尽管基于培养皿的检测结果变化较小（图3A-C）。基于染料的喂养检测的一个耗时的步骤是将食物排入喂养室。多井板，包含60口或更多井，可以费力设置，因为需要精确加载融化的阿加罗斯食品到60口或更多井每板。在培养皿中准备和装载食物的速度比在多井盘中要快得多，因为培养皿只包含两个独立的隔间（图3D）。因此，这种基于培养皿的方法不仅保持了染料检测的稳健性，而且大大减少了用于检测准备的时间和精力，从而显著提高了进料检测的能力和速度。因此，它可以很容易地用于分析大量的飞行线，如在基因筛选项目。
虽然基于染料的检测由于其简单性和速度而提供了高通量的研究途径，但它们无法捕获有关喂养更详细的定量方面的信息，如持续时间或体积。为了克服这个问题，可以在盘子上方安装一个高速摄像头，显示更详细的喂食过程信息，例如每个腔室的喂食时间和频率。此外，其他几个喂养范式可用于补充从染料实验中收集的数据。自动喂食装置，如FLIC27和飞行前体和活动探测器（FlyPAD）34，可以记录喂食的时间动态。CAFE 检测25或手动进料检测35可以测量食物的消耗量。然而，这些方法也有其自身的警告。例如，与 Petri 盘或多井板相比，在实验室中设置自动进料设备的成本非常高。此外，每个设备一次只检测几只苍蝇，使其更容易受到个别动物变异的影响。由于CAFE检测依赖于苍蝇将身体操纵到悬挂在喂食室内的毛细管末端的能力，结果可能因与味觉无关的运动损伤而混淆。
虽然其他方法本身是强大的，基于染料的检测可以是一个更有效的工具，快速发现和分析食物偏好的苍蝇。此外，两种选择的设置可以与尖端技术（如光遗传学36） 集成，以选择性和敏锐地操纵苍蝇的喂养行为。这可以使用菜的一半用于光激活，另一半用于光非活动控制。直接激活或灭活特定神经元有助于确定它们是否在调节喂养行为方面发挥作用。总之，这些结果表明，基于培养皿的两选择喂养检测是一种快速而有力的喂养方法，可以帮助研究人员分析不同生理和代谢状态下的喂养行为。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突或相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者要感谢米廷伟博士帮助他们优化两种选择的喂养检测。他们还要感谢塞缪尔·陈和怀亚特·库尔米斯对手稿的评论。该项目由国家卫生研究院赠款R03 DC014787（Y.V.Z.）和R01 DC018592（Y.V.Z.）和安布罗斯·莫内尔基金会资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Agarose | Thomas Scientific | C756P56 | |
| Clear adhesive | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| Conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Dissection microscope | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF Brilliant Blue | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 anesthesia setup | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| Fly incubator with programmable day/night cycle | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| Fly lines | |||
| Glass dish (microwave-safe) | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Media storage bottle | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm | |||
| Plastic fly vials | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S9378 | |
| Sulforhodamine B | Millipore Sigma | S9012 | |
| Tastant compound of interest | |||
| Vortex mixer | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD05 |
References
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