Un ensayo rápido de preferencia alimentaria en Drosophila
Summary
Presentamos un protocolo para un ensayo de alimentación de dos opciones para moscas. Este ensayo de alimentación es rápido y fácil de ejecutar y es adecuado no sólo para la investigación de laboratorio a pequeña escala, sino también para pantallas de comportamiento de alto rendimiento en moscas.
Abstract
Para seleccionar alimentos con valor nutricional evitando al mismo tiempo el consumo de agentes dañinos, los animales necesitan un sistema de sabor sofisticado y robusto para evaluar su entorno alimentario. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un organismo modelo genéticamente tractable que se utiliza ampliamente para descifrar los fundamentos moleculares, celulares y neuronales de la preferencia alimentaria. Para analizar la preferencia de los alimentos con mosca, se necesita un método de alimentación robusto. Aquí se describe un ensayo de alimentación de dos opciones, que es riguroso, que ahorra costos y es rápido. El ensayo es a base de placa de Petri e implica la adición de dos alimentos diferentes complementados con tinte azul o rojo a las dos mitades del plato. A continuación, ~ 70 precediendo, 2-4 días de edad moscas se colocan en el plato y se les permite elegir entre alimentos azules y rojos en la oscuridad durante unos 90 minutos. El examen del abdomen de cada mosca es seguido por el cálculo del índice de preferencias. A diferencia de las placas multiwell, cada placa Petri toma sólo ~ 20 s para llenar y ahorra tiempo y esfuerzo. Este ensayo de alimentación se puede emplear para determinar rápidamente si a las moscas les gusta o no un alimento en particular.
Introduction
A pesar de las diferencias dramáticas en la estructura anatómica de los órganos gustativos entre moscas y mamíferos, las respuestas conductuales de las moscas a muchas sustancias tástricas son sorprendentemente similares a las de los mamíferos. Por ejemplo, las moscas prefieren el azúcar1,2,3,4,5,6,7,8,aminoácidos9,10y baja sal11,que indican nutrientes, pero rechazan los alimentos amargos12,13,14,15 que son desagradables o tóxicos. En las últimas dos décadas, las moscas han demostrado ser un organismo modelo muy valioso para avanzar en la comprensión de muchas cuestiones fundamentales relacionadas con la sensación del gusto y el consumo de alimentos, incluyendo la detección de tastant, la transducción del sabor, la plasticidad del sabor y la regulación de alimentación16,17,18,19,20. Notablemente, una serie de estudios han demostrado que la transducción del sabor y los mecanismos de circuito neural subyacentes a la percepción del gusto son análogos entre las moscas de la fruta y los mamíferos. Por lo tanto, la mosca de la fruta sirve como un organismo experimental ideal, permitiendo a los investigadores descubrir conceptos y principios conservados evolutivamente que rigen la detección y el consumo de alimentos en el reino animal.
Para investigar la sensación de sabor en las moscas, es fundamental establecer un ensayo rápido y riguroso para medir objetivamente la preferencia alimentaria. A lo largo de los años, varios métodos de alimentación, tales como ensayos a base de tintes11,12,13,21,22,23, el ensayo de respuesta de extensión de proboscis mosca24, el alimentador capilar (CAFE) ensayo25,26, el ensayo Fly Liquid-Food Interaction Counter (FLIC)27y otros métodos combinatorios se han desarrollado para medir cuantitativamente la preferencia alimentaria y/o la ingesta de alimentos para moscas de la fruta28,29,30,31. Uno de los paradigmas de alimentación populares es el ensayo de alimentación a base de tinte de dos opciones utilizando una placa de microtitro multi-well12,21,32 o, como se describe aquí, una pequeña placa de Petri11,22 como cámara de alimentación. Este ensayo está diseñado sobre la base de la transparencia del abdomen de la mosca. Durante este ensayo, las moscas se colocan en la cámara de alimentación y se presentan con dos opciones de alimentos mezclados con tinte rojo o tinte azul. Una vez completado el ensayo, los abdomens de mosca aparecen rojos o azules dependiendo de los alimentos que hayan consumido.
Tanto la placa Petri como los ensayos de alimentación a base de tinte multiwell-plate son altamente robustos y producen aproximadamente los mismos resultados. Utilizando estos dos ensayos, numerosos descubrimientos importantes y avances se han hecho para descifrar los receptores y células altamente diversificados responsables de detectar los gustos de los alimentos y la textura de los alimentos11,12,21,22,32,33. En el ensayo a base de tinte, un paso experimental que requiere un tiempo y esfuerzo considerables es preparar y cargar alimentos en la cámara de alimentación. Para reducir el tiempo de preparación y carga de los alimentos, este ensayo se modificó reemplazando la placa de microtiter multiporípodo por una pequeña placa Petri, que se divide en dos compartimentos iguales. En el ensayo a base de placas de Petri, se añaden dos alimentos diferentes complementados con tinte azul o rojo a las dos mitades del plato. A continuación, ~ 70 precediendo, 2-4 días de edad moscas se colocan en el plato y se les permite elegir entre alimentos azules y rojos en la oscuridad durante unos 90 minutos. A continuación, se examina el abdomen de cada mosca y se calcula el índice de preferencias (PI).
Este ensayo de alimentación de dos opciones basado en placas Petri es asequible, simple y rápido. Una placa multi-well requiere aproximadamente 110 s para llenar, mientras que cada placa Petri toma sólo ~ 20 s. Además, la placa multipobado requiere canalizar pequeños volúmenes de alimentos en un gran número de pequeños pozos (por ejemplo, 60 o más pozos por plato), lo que requiere una precisión y atención considerables. Por el contrario, el ensayo basado en placas De Petri requiere sólo dos acciones por plato. Como el ensayo de alimentación puede implicar un gran número de réplicas, el ensayo basado en placas De Petri ahorra una cantidad notrivial de tiempo y esfuerzo. Este ensayo da resultados equivalentes a los del ensayo a base de múltiples oleajes y ha demostrado tener éxito en abordar muchas preguntas fundamentales en la sensación de sabor, incluyendo la codificación del sabor de la sal11,la plasticidad del sabor modificado por la experiencia alimentaria22,y la base molecular de la sensación de textura de los alimentos33. En resumen, este ensayo de dos opciones basado en placas de Petri es una poderosa herramienta para investigar cómo las moscas perciben los ambientes de nutrientes externos e internos para provocar un comportamiento de alimentación adecuado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método implica varios pasos cruciales donde pueden producirse problemas. En primer lugar, asegúrese de que las moscas ingieren una cantidad suficiente de alimentos para proporcionar datos estables. Si las moscas comen mal, asegúrese de que las moscas hayan estado hambrientas durante al menos 24 h, y que el medio experimental contenga al menos una concentración mínima de sacarosa (2 mM). Para estimular aún más el consumo de alimentos, prolongue el período de inanición húmeda más allá de las 24 h, dependie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quisieran agradecer al Dr. Tingwei Mi por ayudarles a optimizar el ensayo de alimentación de dos opciones. También les gustaría agradecer a Samuel Chan y Wyatt Koolmees por sus comentarios sobre el manuscrito. Este proyecto fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud otorga R03 DC014787 (Y.V.Z.) y R01 DC018592 (Y.V.Z.) y por la Fundación Ambrose Monell.
Materials
| 35 mm Petri dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Agarose | Thomas Scientific | C756P56 | |
| Clear adhesive | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| Conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Dissection microscope | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF Brilliant Blue | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 anesthesia setup | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| Fly incubator with programmable day/night cycle | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| Fly lines | |||
| Glass dish (microwave-safe) | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Media storage bottle | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm | |||
| Plastic fly vials | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S9378 | |
| Sulforhodamine B | Millipore Sigma | S9012 | |
| Tastant compound of interest | |||
| Vortex mixer | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD05 |
References
- Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
- Dahanukar, A., Foster, K., van der Goes van Naters, W. M., Carlson, J. R. A Gr receptor is required for response to the sugar trehalose in taste neurons of Drosophila. Nature Neuroscience. 4 (12), 1182-1186 (2001).
- Ueno, K., et al. Trehalose sensitivity in Drosophila correlates with mutations in and expression of the gustatory receptor gene Gr5a. Current Biology. 11 (18), 1451-1455 (2001).
- Fujii, S., et al. Drosophila sugar receptors in sweet taste perception, olfaction, and internal nutrient sensing. Current Biology. 25 (5), 621-627 (2015).
- Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
- Thorne, N., Chromey, C., Bray, S., Amrein, H. Taste perception and coding in Drosophila. Current Biology. 14 (12), 1065-1079 (2004).
- Slone, J., Daniels, J., Amrein, H. Sugar receptors in Drosophila. Current Biology. 17 (20), 1809-1816 (2007).
- Dus, M., et al. Nutrient sensor in the brain directs the action of the brain-gut axis in Drosophila. Neuron. 87 (1), 139-151 (2015).
- Toshima, N., Tanimura, T. Taste preference for amino acids is dependent on internal nutritional state in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Biology. 215 (16), 2827-2832 (2012).
- Melcher, C., Bader, R., Pankratz, M. J. Amino acids, taste circuits, and feeding behavior in Drosophila: towards understanding the psychology of feeding in flies and man. Journal of Endocrinology. 192 (3), 467-472 (2007).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- Moon, S. J., Kottgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Current Biology. 16 (18), 1812-1817 (2006).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Current Biology. 30 (1), 17-30 (2020).
- Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. Journal of Neuroscience. 32 (4), 1429-1435 (2012).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Current Opinion in Neurobiology. 19 (4), 345-353 (2009).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Scott, K. Gustatory processing in Drosophila melanogaster. Annual Review of Entomology. 63, 15-30 (2018).
- Freeman, E. G., Dahanukar, A. Molecular neurobiology of Drosophila taste. Current Opinion in Neurobiology. 34, 140-148 (2015).
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nature Neuroscience. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Bantel, A. P., Tessier, C. R. Taste preference assay for adult Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e54403 (2016).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder assay measures food intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55024 (2017).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
- Yoshihara, M. Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3625 (2012).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
- Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e56900 (2018).
- Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19 (19), 1623-1627 (2009).
- Zhang, Y. V., Aikin, T. J., Li, Z., Montell, C. The basis of food texture sensation in Drosophila. Neuron. 91 (4), 863-877 (2016).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8, 87 (2015).
- Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).
