विकिरणित बफी कोट से फीडर कोशिकाओं का उपयोग करके टी लिम्फोसाइट्स के अलगाव और संस्कृति के माध्यम से महाधमनी वाल्व कैल्सीफिकेशन की जांच करना
Summary
इस अध्ययन में, हम कैल्सीफाइड महाधमनी वाल्व के ताजा नमूनों से टी लिम्फोसाइट अलगाव की प्रक्रिया और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण का उपयोग करके अनुकूली ल्यूकोसाइट सबसेट के लक्षण वर्णन के लिए टी सेल-क्लोनिंग के विश्लेषणात्मक चरणों का वर्णन करते हैं।
Abstract
कैल्सिफिक महाधमनी वाल्व रोग (सीएवीडी), वाल्व के हल्के मोटा होने से लेकर गंभीर कैल्सीफिकेशन तक की एक सक्रिय रोग प्रक्रिया, ट्रांसकैथेटर महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन (टीएवीआर) जैसे नए चिकित्सीय विकल्पों के बावजूद उच्च मृत्यु दर से जुड़ी हुई है।
वाल्व कैल्सीफिकेशन के साथ शुरू होने वाले और गंभीर महाधमनी स्टेनोसिस का कारण बनने वाले पूर्ण मार्ग केवल आंशिक रूप से समझे जाते हैं। विवो में महाधमनी वाल्व कोशिकाओं का एक करीबी प्रतिनिधित्व प्रदान करके, स्टेनोटिक वाल्व ऊतक से टी लिम्फोसाइट्स की असेइंग कैल्सीफिकेशन के विकास में उनकी भूमिका को स्पष्ट करने का एक कुशल तरीका हो सकता है। सर्जिकल उच्छेदन के बाद, ताजा महाधमनी वाल्व के नमूने को छोटे टुकड़ों में विच्छेदित किया जाता है और टी लिम्फोसाइट्स को सुसंस्कृत किया जाता है, क्लोन किया जाता है फिर प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है।
धुंधला प्रक्रिया सरल है और दाग ट्यूबों को पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 0.5% का उपयोग करके भी ठीक किया जा सकता है और 15 दिनों के बाद तक विश्लेषण किया जा सकता है। स्टेनिंग पैनल से उत्पन्न परिणामों का उपयोग हस्तक्षेप के संबंध में समय के साथ टी सेल सांद्रता में परिवर्तन को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है और आसानी से ब्याज के विशिष्ट टी सेल उपप्रकारों के सक्रियण राज्यों का आकलन करने के लिए आगे विकसित किया जा सकता है। इस अध्ययन में, हम टी कोशिकाओं के अलगाव को दिखाते हैं, जो ताजा कैल्सीफाइड महाधमनी वाल्व नमूनों पर किया जाता है और सीएवीडी पैथोफिजियोलॉजी में अनुकूली प्रतिरक्षा की भूमिका को समझने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके टी सेल क्लोन का विश्लेषण करने के चरण।
Introduction
कैल्सिफिक महाधमनी वाल्व रोग (CAVD) स्वास्थ्य देखभाल पर भारी प्रभाव के साथ सबसे आम हृदय वाल्व विकारों में से एक है। पिछले वर्षों में महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन की आवृत्ति नाटकीय रूप से बढ़ी है और बढ़ती बुजुर्ग आबादी के कारण आगे बढ़ने की उम्मीद है1।
CAVD के अंतर्निहित pathophysiology केवल आंशिक रूप से जाना जाता है और वर्तमान चिकित्सीय रणनीतियों रूढ़िवादी उपायों या महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन तक सीमित हैं, या तो सर्जिकल या percutaneous प्रक्रियाओं के माध्यम से। आज तक, कोई भी प्रभावी चिकित्सा उपचार सीएवीडी प्रगति को बाधित या रिवर्स नहीं कर सकता है और उच्च मृत्यु दर प्रारंभिक लक्षण-शुरुआत से जुड़ी हुई है, जब तक कि महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन (एवीआर) नहीं किया जाता है। गंभीर रोगसूचक महाधमनी स्टेनोसिस वाले रोगियों में, 3 साल के लक्षण-मुक्त अस्तित्व को 20% 3 के रूप में कम बताया गया था। ट्रांसकैथेटर महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन (टीएवीआर) एक नए विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है, विशेष रूप से बुजुर्गों के बीच उच्च जोखिम वाले रोगियों के लिए उपचार में क्रांति लाता है और नाटकीय रूप से मृत्यु दर को कम कर देता है, जो इस आबादी में आंतरिक रूप से उच्च था4,5,6। टीएवीआर के आशाजनक परिणामों के बावजूद, उपन्यास प्रारंभिक चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए सीएवीडी पैथोफिजियोलॉजी को समझने के लिए आगे के शोध की आवश्यकता है7,8,9।
पहले एक निष्क्रिय, अपक्षयी प्रक्रिया माना जाता था, CAVD को अब एक सक्रिय प्रगतिशील बीमारी के रूप में पहचाना जाता है, जो महाधमनी वाल्व अंतरालीय कोशिकाओं के एक ऑस्टियोब्लास्टिक फेनोटाइप स्विच की विशेषता है10। इस बीमारी में प्रगतिशील खनिजीकरण, फाइब्रोकैल्सिफ़िक परिवर्तन और महाधमनी वाल्व पत्रकों (स्केलेरोसिस) की गतिशीलता में कमी शामिल है, जो अंततः महाधमनी वाल्व ओपनिंग 11 के संकुचन (स्टेनोसिस) के लिए अग्रणी रक्त प्रवाह को बाधित करती है।
सूजन को सीएवीडी पैथोफिजियोलॉजी में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया माना जाता है, जो संवहनी एथेरोस्क्लेरोसिस की प्रक्रिया के समान है। एंडोथेलियल चोट लिपिड प्रजातियों के जमाव और संचय को सक्षम बनाती है, विशेष रूप से महाधमनी वाल्व 12 में ऑक्सीकरण लिपोप्रोटीन। ये ऑक्सीकृत लिपोप्रोटीन एक भड़काऊ प्रतिक्रिया को उत्तेजित करते हैं, क्योंकि वे साइटोटॉक्सिक होते हैं, जिसमें भड़काऊ गतिविधि खनिजीकरण के लिए अग्रणी होती है। CAVD विकास और रोग की प्रगति में जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा की भूमिका को हाल ही में हाइलाइट किया गया है। मेमोरी टी कोशिकाओं के विशिष्ट सबसेट के सक्रियण और क्लोनल विस्तार को सीएवीडी और खनिजीकृत महाधमनी वाल्व पत्रक वाले रोगियों में प्रलेखित किया गया है, ताकि भड़काऊ प्रक्रियाओं को कम से कम सीएवीडी के विकास में शामिल माना जा सके और संभवतः रोग की प्रगति में भी शामिल हो। वास्तव में, हालांकि एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाएं और मैक्रोफेज स्वस्थ और रोगग्रस्त वाल्व दोनों में मौजूद हैं, टी लिम्फोसाइट्स की उपस्थिति एक वृद्ध और रोगग्रस्त महाधमनी वाल्व का संकेत है। यह लिम्फोसाइटिक घुसपैठ के साथ-साथ नियोवैस्कुलराइजेशन और मेटाप्लासिया में वृद्धि के साथ-साथ CAVD15 के विशिष्ट हिस्टोलॉजिकल संकेत हैं।
हम महाधमनी वाल्व अंतरालीय कोशिकाओं और प्रतिरक्षा प्रणाली के सक्रियण के बीच एक बातचीत के अस्तित्व की परिकल्पना करते हैं, जो संभावित रूप से महाधमनी वाल्व में एक पुरानी भड़काऊ प्रक्रिया की शुरुआत को ट्रिगर करता है। स्टेनोटिक महाधमनी वाल्व ऊतक से टी कोशिकाओं की असेइंग कैल्सीफिकेशन विकास में उनकी भूमिका को स्पष्ट करने का एक प्रभावी तरीका हो सकता है, क्योंकि यह विवो में महाधमनी वाल्व कोशिकाओं का एक करीबी प्रतिनिधित्व प्रदान कर सकता है। वर्तमान काम में, महाधमनी वाल्व ऊतक का उपयोग करके, हम टी-लिम्फोसाइट्स, संस्कृति को अलग करते हैं और उन्हें क्लोन करते हैं, और बाद में प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग करके उन्हें चिह्नित करते हैं। ताजा महाधमनी वाल्व के नमूनों को सीएवीडी रोगियों से उत्पादित किया गया था, जिन्होंने गंभीर महाधमनी स्टेनोसिस के लिए सर्जिकल वाल्व प्रतिस्थापन प्राप्त किया था। सर्जिकल उच्छेदन के बाद, ताजा वाल्व नमूने को छोटे टुकड़ों में विच्छेदित किया गया था और टी कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया गया था, क्लोन किया गया था, फिर प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। धुंधला प्रक्रिया सरल है और दाग ट्यूबों को पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 0.5% का उपयोग करके ठीक किया जा सकता है और 15 दिनों बाद तक विश्लेषण किया जा सकता है। स्टेनिंग पैनल से उत्पन्न डेटा का उपयोग हस्तक्षेप के संबंध में समय के साथ टी लिम्फोसाइट वितरण में परिवर्तनों को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है और आसानी से ब्याज के विशिष्ट टी सेल सबसेट के सक्रियण राज्यों का आकलन करने के लिए आगे विकसित किया जा सकता है।
कैल्सीफाइड ऊतक का निष्कर्षण, कैल्सीफाइड ऊतक से ल्यूकोसाइट्स का अलगाव और विशेष रूप से इस प्रकार के ऊतकों पर प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग चुनौतीपूर्ण हो सकता है, ऑटोफ्लोरेसेंस जैसे मुद्दों के कारण। इस विशिष्ट उद्देश्य के लिए प्रोटोकॉल के साथ कुछ प्रकाशन मौजूद हैं16,17,18. इसमें हम मानव महाधमनी वाल्व नमूनों से टी लिम्फोसाइट के प्रत्यक्ष अलगाव और संस्कृति के लिए विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए एक प्रोटोकॉल को प्रस्तुत करते हैं। लिम्फोसाइटों का क्लोनल विस्तार अनुकूली प्रतिरक्षा की एक पहचान है। विट्रो में इस प्रक्रिया का अध्ययन लिम्फोसाइट विषमता 19 के स्तर पर व्यावहारिक जानकारी प्रदान करता है। तीन सप्ताह की इनक्यूबेशन अवधि के बाद, टी सेल क्लोन को स्पष्टीकरण देने के लिए तैयार हैं, क्योंकि प्रत्येक क्लोन से पर्याप्त मात्रा में टी कोशिकाएं प्राप्त की गई थीं, ताकि फेनोटाइपिक और कार्यात्मक अध्ययन की अनुमति मिल सके। बाद में टी क्लोन के फेनोटाइप का अध्ययन साइटोफ्लोरोमेट्री द्वारा किया जाता है।
यह प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रोटोकॉल एक विधि का एक अनुकूलन है जिसे पहले एमेदेई एट अल द्वारा विकसित किया गया था टी सेल अलगाव और मानव ऊतक से लक्षण वर्णन के लिए, विशेष रूप से कैल्सीफाइड मानव ऊतक के लिए डिज़ाइन किया गया था, जैसे कि CAVD20,21,22 में। विकिरणित बफी कोट का उपयोग करके पीबीएमसी (परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं) के अलगाव के लिए यहां प्रोटोकॉल फीडर कोशिकाओं (एफसी) को प्राप्त करने के लिए एक प्रभावी तरीके का वर्णन करता है, विशेष रूप से वाल्व अंतरालीय कोशिकाओं से अलग टी लिम्फोसाइट्स के क्लोनिंग चरण के लिए समायोजित किया जाता है। फीडर परत में विकास गिरफ्तार कोशिकाएं होती हैं, जो अभी भी व्यवहार्य और बायोएक्टिव हैं। फीडर कोशिकाओं की भूमिका इन विट्रो अस्तित्व और वाल्व अंतरालीय कोशिकाओं से अलग टी लिम्फोसाइट्स के विकास का समर्थन करने के लिए महत्वपूर्ण है23। संस्कृति में फीडर सेल प्रसार से बचने के लिए, इन कोशिकाओं को विकास गिरफ्तारी से गुजरना चाहिए। यह दो तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है: विकिरण जैसे भौतिक तरीकों के माध्यम से, या साइटोटॉक्सिक रसायनों के साथ उपचार के माध्यम से, जैसे कि मिटोमाइसिन सी (एमएमसी), एक एंटीट्यूमरल एंटीबायोटिक जिसे सीधे संस्कृति की सतह पर लागू किया जा सकता है24। यहां हम सेल विकिरण के माध्यम से प्राप्त फीडर सेल विकास गिरफ्तारी दिखाते हैं।
यह विधि महाधमनी वाल्व ऊतक से टी कोशिकाओं को अलग करने और चिह्नित करने के लिए एक कुशल, लागत प्रभावी तरीका प्रस्तुत करती है, जो सीएवीडी पैथोफिजियोलॉजी की खोज के लिए प्रतिरक्षाविज्ञानी तरीकों के स्पेक्ट्रम को व्यापक बनाने में योगदान देती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके स्टेनोटिक महाधमनी वाल्व के नमूनों से अलग किए गए टी लिम्फोसाइट उप-आबादी को चिह्नित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। इस विधि के लिए PBMCs को अलग करने के लिए विक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी बफी कोट बैग डॉ पीटर रोसेंथल, डॉ डिर्क बोहमर और चारिटे बेंजामिन फ्रैंकलिन के रेडियोलॉजी विभाग की पूरी टीम की उपलब्धता के लिए विकिरणित थे। छात्रवृत्ति धारक / मैरी रॉक्साना क्रिस्टोफर, यह काम जर्मन कार्डियक सोसाइटी (डीजीके) से छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है।
Materials
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
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