Métabolomique quantitative de Saccharomyces Cerevisiae par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem

Summary

Nous présentons un protocole pour l’identification et la quantification des principales classes de métabolites solubles dans l’eau dans la levure Saccharomyces cerevisiae. La méthode décrite est polyvalente, robuste et sensible. Il permet de séparer les isomères structurels et les formes stéréoisomériques de métabolites solubles dans l’eau les uns des autres.

Abstract

La métabolomique est une méthodologie utilisée pour l’identification et la quantification de nombreux intermédiaires et produits de faible poids moléculaire du métabolisme dans une cellule, un tissu, un organe, un fluide biologique ou un organisme. La métabolomique se concentre traditionnellement sur les métabolites solubles dans l’eau. Le métabolome soluble dans l’eau est le produit final d’un réseau cellulaire complexe qui intègre divers facteurs génomiques, épigénomiques, transcriptomiques, protéomiques et environnementaux. Par conséquent, l’analyse métabolomique évalue directement le résultat de l’action pour tous ces facteurs dans une pléthore de processus biologiques au sein de divers organismes. L’un de ces organismes est la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae, un eucaryote unicellulaire avec le génome entièrement séquencé. Parce que S. cerevisiae se prête à des analyses moléculaires complètes, il est utilisé comme modèle pour disséquer les mécanismes sous-jacents à de nombreux processus biologiques au sein de la cellule eucaryote. Une méthode d’analyse polyvalente pour l’évaluation quantitative robuste, sensible et précise du métabolome soluble dans l’eau fournirait la méthodologie essentielle pour disséquer ces mécanismes. Nous présentons ici un protocole pour les conditions optimisées de trempe de l’activité métabolique et d’extraction des métabolites solubles dans l’eau des cellules de S. cerevisiae. Le protocole décrit également l’utilisation de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour l’analyse quantitative des métabolites solubles dans l’eau extraits. La méthode LC-MS/MS de métabolomique non ciblée décrite ici est polyvalente et robuste. Il permet l’identification et la quantification de plus de 370 métabolites solubles dans l’eau ayant diverses propriétés structurelles, physiques et chimiques, y compris différents isomères structuraux et formes stéréoisomériques de ces métabolites. Ces métabolites comprennent diverses molécules porteuses d’énergie, des nucléotides, des acides aminés, des monosaccharides, des intermédiaires de la glycolyse et des intermédiaires du cycle tricarboxylique. La méthode LC-MS/MS de métabolomique non ciblée est sensible et permet l’identification et la quantification de certains métabolites solubles dans l’eau à des concentrations aussi faibles que 0,05 pmol/μL. La méthode a été utilisée avec succès pour évaluer les métabolomes solubles dans l’eau de cellules de levure de type sauvage et mutantes cultivées dans différentes conditions.

Introduction

Les métabolites solubles dans l’eau sont des intermédiaires de faible poids moléculaire et des produits du métabolisme qui contribuent aux processus cellulaires essentiels. Ces processus conservés de manière évolutionnaire comprennent la conversion des nutriments en énergie utilisable, la synthèse de macromolécules, la croissance et la signalisation cellulaires, le contrôle du cycle cellulaire, la régulation de l’expression des gènes, la réponse au stress, la régulation post-traductionnelle du métabolisme, le maintien de la fonctionnalité mitochondriale, le trafic cellulaire vésiculaire, l’autophagie, le vieillissement cellulaire et la mort cellulaire régulée^1,2,3.

Beaucoup de ces rôles essentiels des métabolites solubles dans l’eau ont été découverts par des études dans la levure bourgeonnante S. cerevisiae^1,3,4,7,9,^14,15^{,16,17,18,19,20,21,22}. Cet eucaryote unicellulaire est un organisme modèle utile pour disséquer les mécanismes par lesquels les métabolites solubles dans l’eau contribuent aux processus cellulaires en raison de son aptitude aux analyses biochimiques, génétiques et biologiques moléculaires^avancées23,^24,25,26. Bien que les méthodes LC-MS/MS de métabolomique non ciblée aient été utilisées pour étudier les rôles des métabolites solubles dans l’eau dans les levures bourgeonnantes^3,18,22,27, ce type d’analyse nécessite l’amélioration de sa polyvalence, de sa robustesse, de sa sensibilité et de sa capacité à distinguer les différents isomères structurels et les formes stéréoisomériques de ces métabolites.

Ces dernières années sont marquées par des progrès significatifs dans l’application des méthodes LC-MS/MS de métabolomique non ciblée au profilage des métabolites solubles dans l’eau in vivo. Cependant, de nombreux défis dans l’utilisation de^cetteméthodologie^{restent 2,28 , 29,30},^31,32^,33,34,35,36. Ces défis sont les suivants. Premièrement, les concentrations intracellulaires de nombreux métabolites solubles dans l’eau sont inférieures à un seuil de sensibilité pour les méthodes actuellement utilisées. Deuxièmement, l’efficacité de la trempe de l’activité métabolique est trop faible et l’étendue des fuites cellulaires associées à la trempe des métabolites intracellulaires est trop élevée pour les méthodes actuelles; par conséquent, les méthodes actuellement utilisées sous-estiment les concentrations intracellulaires de métabolites solubles dans l’eau. Troisièmement, les méthodes existantes ne peuvent pas différencier les isomères structuraux (c’est-à-dire des molécules ayant la même formule chimique mais une connectivité atomique différente) ou les stéréoisomères (c’est-à-dire des molécules ayant la même formule chimique et la même connectivité atomique, mais avec un arrangement atomique différent dans l’espace) de métabolites spécifiques; cela empêche l’annotation correcte de certains métabolites par les méthodes actuellement utilisées. Quatrièmement, les bases de données en ligne sur le spectral de masse des ions parents (MS1) et des ions secondaires (MS2) sont incomplètes; cela affecte l’identification et la quantification correctes de métabolites spécifiques à l’aide des données brutes LC-MS/MS produites à l’aide des méthodes actuelles. Cinquièmement, les méthodes existantes ne peuvent pas utiliser un seul type d’extraction de métabolites pour récupérer toutes ou la plupart des classes de métabolites solubles dans l’eau. Sixièmement, les méthodes existantes ne peuvent pas utiliser un seul type de colonne LC pour séparer les unes des autres toutes les classes ou la plupart des classes de métabolites solubles dans l’eau.

Ici, nous avons optimisé les conditions pour la trempe de l’activité métabolique dans les cellules de S. cerevisiae, en maintenant la plupart des métabolites solubles dans l’eau dans ces cellules avant l’extraction et en extrayant la plupart des classes de métabolites solubles dans l’eau des cellules de levure. Nous avons développé une méthode polyvalente, robuste et sensible pour l’identification et la quantification basées sur LC-MS/MS de plus de 370 métabolites solubles dans l’eau extraits de cellules de S. cerevisiae. Cette méthode de métabolomique non ciblée permet d’évaluer les concentrations intracellulaires de diverses molécules porteuses d’énergie, nucléotides, acides aminés, monosaccharides, intermédiaires de glycolyse et intermédiaires du cycle tricarboxylique. La méthode LC-MS/MS développée permet l’identification et la quantification de différents isomères structuraux et formes stéréoisomériques de métabolites solubles dans l’eau ayant diverses propriétés structurelles, physiques et chimiques.

Protocol

1. Fabrication et stérilisation d’un milieu de culture de levure Faire 180 mL d’un extrait de levure complet avec un milieu de bactopéptone (YP). Le milieu YP complet contient 1% (p / v) d’extrait de levure et 2% (w / v) de bactopéptone. Répartir 180 mL du milieu YP également dans quatre flacons d’Erlenmeyer de 250 mL. Chacune de ces fioles contient 45 mL du milieu YP. Stériliser les flacons avec un milieu YP par autoclavage à 15 psi/121 °C pendant 45 min. <p class=…

Representative Results

Pour améliorer une évaluation quantitative des métabolites solubles dans l’eau dans une cellule de levure, nous avons optimisé les conditions de trempe cellulaire pour la détection des métabolites. La trempe cellulaire à cette fin implique un arrêt rapide de toutes les réactions enzymatiques au seind’unecellule31,33,37,38. Un tel arrêt de l’activ…

Discussion

Pour utiliser avec succès le protocole décrit ici, suivez les mesures préventives décrites ci-dessous. Le chloroforme et le méthanol extraient diverses substances de la matière plastique de laboratoire. Par conséquent, manipulez-les avec prudence. Évitez l’utilisation de plastiques dans les étapes qui impliquent un contact avec l’un de ces deux solvants organiques. Utilisez des pipettes en verre borosilicate pour ces étapes. Augmentez ces pipettes avec du chloroforme et du méthanol avant utilisation. Utili…

Materials

Chemicals
Acetonitrile	Fisher Scientific	A9554
Ammonium acetate	Fisher Scientific	A11450
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Bactopeptone	Fisher Scientific	BP1420-2
Chloroform	Fisher Scientific	C297-4
Glucose	Fisher Scientific	D16-10
L-histidine	Sigma	H8125
L-leucine	Sigma	L8912
L-lysine	Sigma	L5501
Methanol	Fisher Scientific	A4564
Methanol	Fisher Scientific	A4564
Propidium iodide	Thermo Scientific	R37108
Uracil	Sigma	U0750
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles	Beckman	355664
Agilent 1100 series LC system	Agilent Technologies	G1312A
Beckman Coulter Centrifuge	Beckman	6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor	Beckman	JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge	Thermo Scientific	004260F
Digital thermometer	Omega	HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer	Thermo Scientific	02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm)	Sigma Milipore	150460
Thermo Orbitrap Velos MS	Fisher Scientific	ETD-10600
Ultrasonic sonicator	Fisher Scientific	15337416
Vortex	Fisher Scientific	2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm	Agilent Technologies	883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps	Fisher Scientific	60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm)	Sigma-Aldrich	G8772
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps	PYREX	05-550
Software
Compound Discoverer 3.1	Fisher Scientific	V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742	Dharmacon	YSC1049